「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養
Summary
卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。
Abstract
哺乳類の女性は、各発情周期中に卵母細胞数をほぼ一定を定期的に排卵します。このような規則性と周期性を維持するためには、視床下部-下垂体-性腺軸レベル、卵巣内の卵胞の開発に規制が発生します。アクティブな研究にもかかわらずいくつか手順休眠原始卵胞活性化から排卵して卵胞の各段階で異なる規制の複雑さのため、卵胞の発達メカニズムは明らかありません。卵胞発育のメカニズムと発情サイクルを通して卵胞のダイナミクスを調べるためには、顕微鏡を用いて卵胞の発育を観察するために使用できるマウス卵巣組織培養モデルを開発しました。体系的な卵胞発育、周期的な排卵と卵胞閉鎖すべてで再現できる卵巣培養モデルと培養条件を実験的変調することができます。ここでは、卵胞発育の調節機構とその他卵巣現象における本法の有用性を示す.
Introduction
雌マウス卵巣いくつか千包1、および周期的な排卵発情サイクルごとに約 10 卵母細胞が成熟します。卵胞は、いくつかの発達段階に分類: 原初、プライマリ、セカンダリ、幽門洞、および各卵子を取り巻く顆粒膜細胞層の形態によって、グラーフ卵胞。ほとんどの原始卵胞が休止状態とそれらのいくつかはアクティブし各発情周期2プライマリ卵胞に成長します。二次濾胞ステージ後卵胞発育は主に性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン (FSH) と黄体形成ホルモン (LH) によって調整されます。しかし、原始、プライマリ卵胞発育、性腺刺激ホルモンとは無関係です、これらの段階を支配する制御機構のまま悪い inderstood3,4,5。成長因子およびホルモンのほか、原始、プライマリ卵胞は卵胞6,7間の相互作用によって調整されます。したがって、マウス卵巣組織の卵胞動力学の解析を実行し、卵巣の組織培養8,9,10を使用して関連付けられている規制メカニズムを検討しました。
ここで、2 つの卵巣組織培養モデルのメソッドを紹介します。最初、卵胞の測定により卵胞発育を分析するため、2 番目はトランスジェニック マウスとセカンダリ卵胞期に原始から初期の卵胞発育中規制機構の研究使用されます。小胞の開発の分析、主に使用しました 4 週齢の雌マウスの卵巣卵胞を簡単に表示できるため。定期的な排卵とモデル生体内で卵胞発育を誘導するには、培養条件下でのエストラジ オールの分泌卵胞閉鎖と観測された排卵 LH サージが再現されております。培養の卵巣のイメージが捕獲されたと濾胞領域でトレースの変更によって卵胞の開発プロセスを分析しました。ただし、明視野顕微鏡解析で原始と初期プライマリ卵胞の区別は明確です。したがって、小卵胞を検出、原初、プライマリ、区別する手法を開発したし、の二次卵胞培養を用いた卵巣組織Oogenesin1 (Oog1) pro3 。9 と 0 と 4 日誕生11 R26 H2B mCherryトランスジェニック マウスの卵巣。Oog1式減数分裂、参入後は、卵母細胞の検出と原初から培養卵巣組織11 時間経過画像を用いたプライマリ卵胞への移行が観察、卵胞の発育とともに徐々 に増大 ,12。形態学的方法は、休止状態の原始卵胞13,14,15,16を活性化する要因を検討し使用されている、卵巣の生理学的な卵胞発育が観察することは困難、様々 な要因の影響残る例を紹介。本培養法は、ターゲット要素のリアルタイム解析でこの不足に対処するため設計されました。
本研究で我々 はタイムラプス イメージング法による卵胞の発育を追跡され、卵胞発育のプロセスが特徴します。私たちの手法は、卵巣の生理学を調査するための前例のないツールを提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究ではマウス卵巣における卵胞発育を研究するための 2 つの新しい方法を開発しました。最初のメソッドは卵胞発育の解析に続いてスライスした卵巣成熟マウス組織の文化を含み、2 番目には段階では、性腺刺激ホルモンに依存しない初期の卵胞発育を視覚化する時間経過イメージ投射の使用が含まれます。以前は、卵胞開発8,9日白血病の抑制…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は博士直次郎南 (京都大学) がOog1pro3.9マウスを提供することをありがちましょう。本研究は、日本学術振興会 (科研費 # JP15H06275) と日東財団によって支えられました。
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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