Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique
Summary
Cet article décrit des méthodes spécifiques pour obtenir des quantités biochimiques de TRPV1 solubilisée détergent pour analyse spectroscopique. Les protocoles combinés offrent des outils biochimiques et biophysiques qui peuvent être adaptées afin de faciliter les études structurales et fonctionnelles des canaux ioniques mammifères dans un environnement contrôlé en membrane.
Abstract
Canaux ioniques polymodal transduce multiples stimuli de différentes natures allostérique de l’évolution ; ces conformations dynamiques sont difficiles à déterminer et demeurent largement inconnus. Avec les progrès récents en lumière délestage de la particule cryo-electron microscopy (cryo-EM) sur les caractéristiques structurales des sites de fixation agoniste et le mécanisme d’activation de plusieurs canaux ioniques, le décor est planté pour une analyse approfondie et dynamique de leurs processus de blocage mécanismes utilisant des méthodes spectroscopiques. Techniques spectroscopiques comme la résonance paramagnétique électronique (RPE) et électron-électron double résonance (cerf) ont été principalement limités à l’étude des canaux ioniques procaryotes qui peut être purifié en grandes quantités. L’obligation pour les grandes quantités de protéines membranaires fonctionnelle et stable a entravé l’étude des canaux d’ion mammifères à l’aide de ces approches. EPR et DEER offre de nombreux avantages, y compris la détermination de la structure et des changements dynamiques des régions de la protéine mobile, mais à basse résolution, ce qui pourrait être difficile d’obtenir par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM, et suivi d’une ouverture de porte réversible transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). Ici, nous fournissons des protocoles pour l’obtention de milligrammes de récepteur transitoire fonctionnel solubilisée détergent potentiels cation V membre du subfamily canal 1 (TRPV1) qui peut être marqué pour la spectroscopie RPE et le cerf.
Introduction
Avec les progrès récents dans la particule cryo microscopie électronique (cryo-EM), structures de canal ionique mammifères ont été obtenus à un rythme extraordinaire. En particulier, des études structurales des canaux ioniques de polymodal, tels que le récepteur transitoire potentiels VANILLOÏDE 1 (TRPV1), ont fourni davantage comprendre son activation des mécanismes1,2,3, 4 , 5. Toutefois, des informations dynamiques sur les canaux ioniques intégrée dans un environnement membranaire sont nécessaires pour comprendre leurs mécanismes de blocage et drogue-liaison polymodal.
Résonance paramagnétique électronique (RPE) et la spectroscopie de résonance (cerf) double électron-électron ont fourni certains des modèles mécanistes plus définitifs pour ion canaux6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. ces approches ont été principalement limitées à l’examen des procaryotes et des canaux d’archeal ion qui produisent une grande quantité de protéines purifiées détergent lorsque surexprimée dans les bactéries. Avec le développement de la production de protéines eucaryotes membrane dans l’insecte et des cellules de mammifères pour la caractérisation structurale et fonctionnelle de15,14,16, il est maintenant possible d’obtenir biochimiques quantités de protéines purifiées détergent pour études spectroscopiques.
Les signaux RPE et DEER découlent d’une étiquette de paramagneticspin (SL) (p. ex., méthanethiosulfonate) fixée à un résidu cystéine-unique dans la protéine. Les marqueurs de spin rapport trois types d’informations structurelles : motion, accessibilités et distances. Ces informations permettent de déterminer si les résidus sont enterrés dans la protéine ou sont exposés à la membrane ou le milieu aqueux dans l’apo et le ligand lié aux États13,17,18,19. Dans le cadre d’une structure à haute résolution (si disponible), les données de l’EPR et le cerf fournissent une collection des contraintes qui fixeront les modèles dynamiques dans leur environnement natif tout en surveillant réversible gating transition (c.-à-d., fermée, ouverte, sensibilisés et désensibilisés). En outre, régions flexibles qui peuvent être difficiles de déterminer par cristallographie aux rayons x ou cryo-EM pourraient être obtenues en utilisant ces ensembles de données environnementales pour attribuer les structures secondaires ainsi que l’emplacement au sein de la protéine20. Structures de Cryo-EM obtenues en lipides nanodiscs a fourni des informations précieuses sur le déclenchement de l’ion canaux3,21,22,23,24, 25; Cependant, méthodes spectroscopiques pourraient fournir des informations dynamiques des États conformationnels (p. ex., changements thermiques) qui peut être difficile de déterminer à l’aide de cryo-EM.
Nombreuses difficultés doivent être surmontées pour implémenter l’EPR et les cerfs, notamment le manque de fonction de protéine en enlevant tous les résidus de cystéine (particulièrement abondants dans les canaux de mammifères), rendement faible en protéines, l’instabilité de la protéine durant la purification et après marquage de spin et l’agrégation de la protéine de détergent ou de liposomes. Ici, nous avons conçu des protocoles à surmonter ces obstacles essentiels et ont obtenu des renseignements de spectres DEER et EPR pour un récepteur sensoriel chez les mammifères. Le but ici est de décrire les méthodologies pour la construisent de l’expression, purification, étiquetage et reconstitution d’un rat fonctionnelle de la cystéine-moins minime TRPV1 (eTRPV1) pour les analyses spectroscopiques. Cette méthode est appropriée pour les protéines de la membrane qui gardent leur fonction malgré l’élimination des résidus de cystéine ou qui contiennent des cystéine formant des ponts disulfures. Cette collection de protocoles pourrait être adaptée pour l’analyse spectroscopique d’autres canaux d’ion chez les mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Expression et purification des protéines membranaires chez les mammifères, les technologies actuelles ont permis d’obtenir des quantités suffisantes de protéines pour des études spectroscopiques14,15,16,,42. Ici, nous avons adapté ces technologies pour exprimer, purifier, reconstituer et effectuez des analyses spectroscopiques en TRPV1.
Parmi les étapes cruc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes très reconnaissants à m. H. Mchaourab pour accéder à des spectromètres EPR et cerfs et Dr T. Rosenbaum pour fournir le plasmide de TRPV1 cystéine-moins long.
Materials
| QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit | Agilent Technologies | 210519-5 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fisher Scientific | A416 | |
| Albumin Bovine Serum (BSA) | GoldBio.com | A-420-10 | |
| Amylose resin | NEB | E8021L | |
| Aprotinin | GoldBio.com | A-655-25 | |
| Asolectin from Soybean | Sigma | 11145 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen Life Technologies | 10359016 | |
| Biobeads SM-2 Adsorbents | Bio-Rad | 152-3920 | |
| Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) | Drummond Scientific | 3-000-203 G/X | |
| Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) | Sutter Instrument | B150-110-10HP | |
| CaCl2 2H2O | Fisher Scientific | C79 | |
| Carbenicillin (Disodium) | GoldBio.com | C-103-5 | |
| Cellfectin Reagent | Invitrogen Life Technologies | 10362-010 | |
| cellSens | Olympus | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606SK | |
| Collagenase Type 1 | Worthington-Biochem | LS004196 | |
| Critiseal | VWR | 18000-299 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| D-(+)-Maltose Monohydrate | Fisher Scientific | BP684 | |
| DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Sigma | D0572 | |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 45-000-148 | |
| EGTA | Fisher Scientific | O2783 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F-14201 | |
| GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Science, Inc | 2160250 | |
| GenCatch PCR Cleanup Kit | Epoch Life Science, Inc | 2360050 | |
| Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
| Glass capillary (25 µl) | VWR | 53432-761 | |
| Glass Flask 2800 mL | Pyrex USA | 4423-2XL | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229 | |
| HEK293S GnTl- | ATCC | CRL-3022 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) | GoldBio.com | I2481C25 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217 | |
| LB Broth, Miller | Fisher bioReagents | BP1426 | |
| Leupeptin Hemisulfate | GoldBio.com | L-010-5 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Life Technologies | 11668-019 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | BP214 | |
| MgSO4 7H2O | Fisher Scientific | BP213 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Ambion | AM1344 | |
| MOPS | Fisher bioReagents | BP2936 | |
| MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate | Toronto Research Chemicals, Inc | O873900 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-062 | |
| Pepstatin A | GoldBio.com | P-020-5 | |
| Pluronic Acid F-127 (20%) | PromoKine | CA707-59004 | |
| PMSF | GoldBio.com | P4170 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Sealed capillary | VitroCom | special order | |
| SF-900 II SFM (insect cell medium) | Gibco, Life Technologies | 10902-088 | |
| Sf9 Cells (SFM Adapted) | Invitrogen Life Technologies | 11496-015 | |
| Soybean Polar Lipid Extract | Avanti Polar Lipids, Inc | 541602C | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590 | |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 29091596 | |
| TCEP HCl | GoldBio.com | TCEP1 | |
| Tetracyclin Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| Tris Base | Fisher BioReagents | BP152 | |
| Tryptone | Difco | 0123-01 | |
| X-gal | GoldBio.com | X4281C | |
| Xenopus oocytes | Nasco | LM00935M | |
| XL1 – Blue Competent Cells | Agilent Technologies, Inc | 200249 | |
| Yeast Extract | Difco | 0127-01-7 | |
| Econo-Pack chromatography column | Bio-Rad | 7321010 | |
| Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels | Bio-Rad | 17000436 | |
| pFastBac1 Expression Vector | Invitrogen Life Technologies | 10360-014 | |
| DH10Bac Competent Cells | Invitrogen Life Technologies | 10361-012 | |
| Critiseal capillary tube sealant | Leica Microsystems | 02-676-20 | |
| ABI Model 3130XL Genetic Analyzers | Applied Biosystems | 4359571 | |
| Transfer pipete | Fishebrand | 13-711-9AM | |
| Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 |
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