使用宽场荧光显微镜测量用于力学生物学研究的软硅胶基底的刚度

摘要

刚度在千帕范围内的基底可用于研究细胞对生理相关微环境刚度的响应。仅使用宽场荧光显微镜，即可通过使用合适微球进行压痕实验来测定软硅胶的杨氏模量。

摘要

人体内的软组织通常具有千帕（kPa）量级的刚度。因此，硅胶和水凝胶等柔性基底已被证实可用于细胞培养，提供一种在物理微环境上部分模拟天然组织特性的基底 体内 条件。本文介绍一种简单的方法，用于表征力学生物学研究中常用的各向同性线性弹性基底的杨氏模量。该方法包括：在培养皿或硬质硅胶上制备软硅胶基底，将荧光微球涂覆于硅胶基底的上表面，利用毫米级小球通过重力作用对硅胶上表面进行压痕，使用宽场荧光显微镜对压痕后硅胶表面的荧光微球成像，并分析所得图像以计算硅胶基底的杨氏模量。在硅胶基底上表面同时结合模量匹配的细胞外基质蛋白（除荧光微球外），可使该硅胶基底直接用于细胞铺板，并进一步开展牵引力显微镜实验。采用硬质硅胶而非培养皿作为软硅胶基底的支撑基底，可支持涉及外部拉伸的力学生物学研究。本方法的一个显著优势在于，所需主要设备为宽场荧光显微镜，而该设备在大多数实验室中均常见。我们通过测量不同弹性模量的软硅胶基底的杨氏模量，验证了该方法的可行性。

引言

软组织中的细胞所处的微环境刚度通常在千帕（kPa）范围内¹，而传统组织培养皿的刚度则高出数个数量级。早期在包被了细胞外基质蛋白的软质基底上进行的细胞实验表明，基底刚度会影响细胞在基底表面的迁移行为以及对下方细胞外基质的黏附能力^2,3。事实上，基底刚度对细胞功能具有根本性影响⁴ ，其作用方式类似于广泛存在的生化信号。聚丙烯酰胺凝胶（包被细胞外基质蛋白后）是一种可透水的水凝胶，已被广泛用作力学生物学研究中的细胞培养基底⁵。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是最常见的硅酮（聚硅氧烷），长期以来被用作刚度在兆帕（MPa）范围内的硬质硅材料，适用于微米尺度的器件制备⁶。近年来，刚度更接近生理条件、处于千帕范围的软质硅基底也被用于力学生物学研究中的细胞培养^7,8。

已有多种方法用于测量柔性基底的刚度，包括原子力显微镜、对整个样品拉伸时的宏观形变、流变学，以及使用球体或球形探针的微压痕法⁹。尽管每种技术都有其优缺点，但使....

方案

1. 软硅胶基底的制备

1. 使用（聚苯乙烯）称量盘，从软质硅胶弹性体试剂盒中称取1.75 g A组分和1.75 g B组分（A:B = 1:1）。
2. 将A组分加入称量盘中的B组分中，并使用适当的涂布棒混合5分钟。
3. 将上述混合物倒入一个35 mm的培养皿中。静置数分钟，使混合物均匀铺展。
   注意：培养皿的直径和软质硅胶的用量将决定硅胶层的厚度。此处厚度约为3.5 mm；有关弹性体厚度选择的更多内容，请参见讨论部分。
4. 将装有硅胶混合物的培养皿（不加盖）放入真空腔中抽真空15分钟，以去除其中的气泡。在此期间，将加热板预热至70 °C。
5. 当加热板达到70 °C后，先将一块载玻片放置在加热板上，然后将装有硅胶混合物的培养皿置于载玻片上。在70 °C下加热固化硅胶30分钟。切勿将聚苯乙烯培养皿直接放置在加热板上，以免培养皿受热熔化。

2. 将荧光微珠与软质硅胶偶联

1. 将已固化的软质硅胶（置于未加盖的培养皿中）放入深紫外（UV）腔室（内含波长为185 nm和254 nm的深紫外灯的密闭腔室）中。将软质硅胶样品置于距离紫外灯约5 - 10 cm处，暴露于深紫外光下5分钟。
   1. 在硅胶暴露于深紫外光的同时，继续进行以下步骤2.2 - 2.6。深紫外照射结束后，在取出样品前，需对深紫外腔室抽气至少5分钟....

结果

根据上述详细方案，我们在35 mm培养皿中制备了软质硅胶，并在70 °C下固化30分钟，随后将荧光微球（及I型胶原）偶联至其表面顶部，如图1示意图所示。此前已有研究使用深紫外光（deep UV）实现蛋白质与基底的最终偶联¹³。需注意：（I）此处所用的固化条件专用于此种软质硅胶；（II）压痕测量在次日进行，因为软质硅胶在一天内会继续略微固化。

表征硅胶表面球形压痕的各种参数如图 2A所示。相位成像用于获取（I）压头的完整图像（如图 2B所示，必要时采用图像拼接）或（II）球体的部分图像。从压头图像中唯一需要提取的参数是其直径。例如，在本实验方案中使用1:1软硅胶时，同一批次的不同压头直径范围为950 µm至1,200 µm，平均值为1,037 µm，标准差为47 µm（共8个压头）。请注意，在计算由特定压头.......

讨论

尽管球形压痕法易于实施，但仍需仔细选择压头以及软硅胶样品的厚度。用于计算杨氏模量的方程仅在一组特定条件下成立¹¹且这些条件通常在硅胶样品厚度满足时达成 > 压头半径的10% < 约为压头半径的13倍。我们发现，硅胶厚度为压头半径的5至10倍是一个较优选择，此时样品厚度不会过高（即，工作距离不会成为限制因素），且计算得到的刚度对硅胶厚度的确切值也不过于敏感。球形压头的选择应确保压痕深度δ满足 < 硅胶厚度的10%以及 < 压头半径的10%。基于上述考虑，可使用不同材质和直径的压头来测量较软或较硬硅胶的刚度。本方案中最关键的步骤是确定压痕深度。本方案建议采用的方法是识别合焦图像，以可靠地确定压痕深度。还应注意，球形压痕法所用的刚度计算基于赫兹理论，该理论假设为无摩擦接触。在此，对于表面粗糙度较低的压头，这一假设是合理的。尽管我们使用了一种特定的软质硅胶弹性体（见配套材料清单中的产品） 特定试剂一览表），也可使用其他商用硅胶弹性体试剂盒。需注意，常用于微加工的硬质硅胶并不适合制备刚度在千帕（kPa）范围的基底。然.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CY 52-276 A/B 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning	CY 52-276	室温保存
Thermo Scientific Pierce EDC	Fisher Scientific	PI22980	于 -20°C 保存
Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS 交联剂	Fisher Scientific	PI-24510	于 4°C 保存
羧基荧光粉红色颗粒，0.4–0.6 µm，2 mL	Spherotech, Inc.	CFP-0558-2	于 4°C 保存，切勿冷冻
1.0 mm 酸洗氧化锆珠	OPS Diagnostics LLC	BAWZ 1000-250-33
深紫外臭氧清洗腔	Novascan Technologies, Inc.	PSD-UV4, OES-1000D
宽场荧光显微镜	Leica Microsystems	DMi8
Ⅰ型胶原蛋白，来自大鼠尾腱	Corning	354236	储存浓度 = 4 mg/mL；于 4°C 保存
ImageJ-NIH	N/A	N/A	公共领域软件