Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом

Summary

Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.

Abstract

Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.

Introduction

Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона¹, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под^2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток⁴ в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного....

Protocol

1. Изготовление мягкого силикона субстрата

1. Весят, 1,75 г компонента A и 1,75 г компонента B (: b = 1:1) из мягкого силикона эластомер комплекта с помощью (полистирол) весом поддонов.
2. Добавьте компонент A B компонент в лотке весом и смешивать их вместе в течение 5 мин, используя соответствующие Аппликатор ручки.
3. Добавьте выше смеси до 35 мм Петри. Разрешить смесь равномерно распределены по Петри за пару минут.
   Примечание: Выбор Петри блюдо диаметр и количество мягкого силикона определит толщина мягкого силикона. Здесь толщина будет около 3,5 мм; Подробнее о выборе толщина эластомера в разделе обсуждения .
4. Мест....

Results

Используя протокол, подробно говорилось выше, мы подготовили мягкого силикона в 35 мм Петри, вылечить при 70 ° C за 30 мин и сочетании флуоресцентные микрошарики (и коллаген я) к верхней поверхности как схематично изображены на рисунке 1. Глубокая УФ ранее использовались для возможного белка, муфты для субстратов¹³. Обратите внимание, что (I) лечения условия, используемые здесь являются специфическими для этого мягкого силикона и .......

Discussion

В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий¹¹и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от радиуса indentor и < ~ 13 x indentor радиус. Мы обнаружили, что силиконовые толщиной 5-10 x indentor радиус был хороший выбор, где толщина образца не слишком высока (т.е., объективные рабочее расстояние не стать огра.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CY 52-276 Комплект силиконовых эластомеров A/B	Dow Corning	CY 52-276	Хранить при комнатной температуре
Thermo Scientific Pierce EDC	Fisher Scientific	PI22980	Хранить при -20°С; C
Thermo Scientific  Сшивающий агент Pierce Sulfo-NHS	Fisher Scientific	PI-24510	Магазин по адресу 4° C
Карбоксиловые флуоресцентные розовые частицы, 0,4-0,6 &; м, 2 мл	Сферотек, Инк.	CFP-0558-2	Склад при 4° C, не замораживать
1,0 мм Промытые кислотой циркониевые шарики	OPS Diagnostics LLC	BAWZ 1000-250-33
Глубокая УФ-камера с озоновым эвакуатором	Novascan Technologies, Inc.	PSD-UV4, OES-1000D
Широкопольный флуоресцентный микроскоп	Leica Microsystems	DMi8
Collagen I, из крысиного хвоста	Corning	354236	Стоковая концентрация = 4 мг/мл; хранить при 4°С; C
ImageJ-NIH	N/A	Программное	обеспечение, находящееся в общественном достоянии