Effektiv rening och LC-MS/MS-baserad analys utveckling för tio-elva translokation-2 5-metylcytosin dioxygenas
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för en effektiv enda steg rening av aktiva otaggade människa tio-elva translokation-2 (TET2) 5-metylcytosin dioxygenas använder jonbyteskromatografi- och dess analys med hjälp av en flytande kromatografi-tandem mass masspektrometri (LC-MS/MS)-baserat tillvägagångssätt.
Abstract
Epigenetiska transkription förordningen medieras av 5-metylcytosin (5mC) har spelat en avgörande roll i eukaryota utveckling. Demetylering av märkena epigenetiska åstadkoms genom sekventiell oxidation av tio-elva translokation dioxygenases (TET1-3), följt av tymin-DNA glykosylas-beroende base excision reparation. Inaktivering av TET2-genen på grund av genetiska mutationer eller genom andra epigenetiska mekanismer är associerade med en dålig prognos hos patienter med olika cancerformer, särskilt hematopoetiska maligniteter. Här beskriver vi en effektiv enda steg rening av enzymatiskt aktiva otaggade mänskliga TET2-dioxygenas med katjonbytare kromatografi. Vi tillhandahåller ytterligare en liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) tillvägagångssätt som kan separera och kvantifiera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5-metyl, 5-hydroxymetyl, 5-formyl, och en 5-karboxylgrupp). Denna analys kan användas för att utvärdera aktiviteten av vildtyp och mutant TET2 dioxygenases.
Introduction
Cytosin baser inom CpG dinucleotides C5 position är den dominerande metylering webbplatsen (5mCpG) i däggdjur genomen1. Dessutom ett antal nyligen genomförda studier har avslöjat omfattande C5 cytosin metylering (5mC) i icke-CpG platser (5mCpH, där H = A, T, eller C)2,3. 5mC modifiering fungerar som transkriptionell ljuddämpare på endogena retrotransposons och gen promotorer3,4,5. DNA-metylering på 5mC också spelar viktiga roller i X-kromosomen inaktivering, gen imprinting, nukleära omprogrammering och vävnadsspecifika gen uttryck5,6,7. Metylering av cytosin vid C5 position utförs av DNA-metyltransferaser och mutationer i dessa enzymer orsaka betydande defekter8. Avlägsnande av 5mC märken initieras av TET1-3 5mC oxidases9,10. Dessa TET-familjen dioxygenases konvertera 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) av sekventiell oxidation steg11,12,13. Slutligen, tymin-DNA glykosylas ersätter 5fC eller 5caC till omodifierade cytosin med base excision repair väg11.
Den mänskliga TET2 -genen identifierades som en ofta muterad gen i olika hematopoietiska maligniteter inklusive myelodysplastiskt syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferativa neoplasmer ( MDS-MPN), och akut myeloisk leukemi (AML) med ursprung från MDS och MDS-MPN16. Nivåerna av 5hmC ändring i benmärgen DNA är lägre hos patienter med TET2 mutationer jämfört med dem med vildtyp (wt)-TET214. Ett antal grupper har utvecklat TET2-knockout musmodeller för att belysa dess roll i normal blodbildning och myeloisk omvandling17,18,19,20. Dessa möss med mutationer i genen TET2 var initialt normal och lönsamt, men yttrar sig olika hematopoietiska maligniteter som de äldre orsakar deras tidiga död. Dessa studier visade de viktiga roller i wt-TET2 normala hematopoetiska differentiering. I dessa musmodeller, heterozygot hematopoetiska stamceller (TET2+/- Förenta) och homozygot TET2– / – hade Förenta en konkurrensfördel gentemot homozygot wt-TET2 Förenta i återinplantering hematopoetiska härstamningar som båda TET2+/- och TET2– / – Förenta utvecklat olika hematopoietiska maligniteter17,18. Dessa studier visar att haploinsufficiency av TET2 dioxygenas förändrar utvecklingen av Förenta och resulterar i hematopoetiska maligniteter.
Liknar möss med mutationer i genen TET2, de flesta leukemipatienter manifestera haploinsufficiency TET2 dioxygenas verksamhet. Dessa mestadels heterozygot somatiska mutationer inkluderar ram-Skift och nonsens mutationer spridda över hela TET2 gen kroppen medan missense mutationer som är mest klustrade i dioxygenas domän12. Hittills har rapporteras lite karakterisering av wt – och mutant-TET2 i litteraturen främst på grund av svårigheter med produktionen av TET2 dioxygenas och dess analys21. Vi rapporterar här, en enkel steg rening av infödda TET2-dioxygenas använder jonbyteskromatografi. Ytterligare, en kvantitativ LC-MS/MS-analys var optimerad och används för att mäta den enzymatiska aktiviteten av infödda TET2-dioxygenas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutationer i TET2-genen är några av de vanligaste identifierade genetiska förändringarna hos patienter med varierande hematopoetiska maligniteter. Hittills hundratals olika TET2-mutationer, bland annat nonsens, ram-Skift och missense mutationer, har identifierats i patienter12. Patienter med TET2 mutationer uppvisar låga nivåer av genomisk 5hmC i benmärgen jämfört med dem med wt-TET214. Mutant TET2 inpressning experiment har återgetts effekterna …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har finansierats av US-avdelningen av försvar i form av en Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi och MDS Foundation Grant, och UMRB bidrag till M.M. Authors tacka Mohit Jaiswal och Subhradeep Bhar för inledande kloning av TET2 i pDEST14 vektor.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
- Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
- Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
- Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
- Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
- Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
- Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
- Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
- Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
- Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
- Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
- Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
- Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
- Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
- Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum’s disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
- Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum’s disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
- Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
- Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
- Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).
