Här presenterar vi ett protokoll för en effektiv enda steg rening av aktiva otaggade människa tio-elva translokation-2 (TET2) 5-metylcytosin dioxygenas använder jonbyteskromatografi- och dess analys med hjälp av en flytande kromatografi-tandem mass masspektrometri (LC-MS/MS)-baserat tillvägagångssätt.
Epigenetiska transkription förordningen medieras av 5-metylcytosin (5mC) har spelat en avgörande roll i eukaryota utveckling. Demetylering av märkena epigenetiska åstadkoms genom sekventiell oxidation av tio-elva translokation dioxygenases (TET1-3), följt av tymin-DNA glykosylas-beroende base excision reparation. Inaktivering av TET2-genen på grund av genetiska mutationer eller genom andra epigenetiska mekanismer är associerade med en dålig prognos hos patienter med olika cancerformer, särskilt hematopoetiska maligniteter. Här beskriver vi en effektiv enda steg rening av enzymatiskt aktiva otaggade mänskliga TET2-dioxygenas med katjonbytare kromatografi. Vi tillhandahåller ytterligare en liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) tillvägagångssätt som kan separera och kvantifiera de fyra normala DNA-baserna (A, T, G och C), samt de fyra modifierade cytosin baserna (5-metyl, 5-hydroxymetyl, 5-formyl, och en 5-karboxylgrupp). Denna analys kan användas för att utvärdera aktiviteten av vildtyp och mutant TET2 dioxygenases.
Cytosin baser inom CpG dinucleotides C5 position är den dominerande metylering webbplatsen (5mCpG) i däggdjur genomen1. Dessutom ett antal nyligen genomförda studier har avslöjat omfattande C5 cytosin metylering (5mC) i icke-CpG platser (5mCpH, där H = A, T, eller C)2,3. 5mC modifiering fungerar som transkriptionell ljuddämpare på endogena retrotransposons och gen promotorer3,4,5. DNA-metylering på 5mC också spelar viktiga roller i X-kromosomen inaktivering, gen imprinting, nukleära omprogrammering och vävnadsspecifika gen uttryck5,6,7. Metylering av cytosin vid C5 position utförs av DNA-metyltransferaser och mutationer i dessa enzymer orsaka betydande defekter8. Avlägsnande av 5mC märken initieras av TET1-3 5mC oxidases9,10. Dessa TET-familjen dioxygenases konvertera 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxylcytosine (5caC) av sekventiell oxidation steg11,12,13. Slutligen, tymin-DNA glykosylas ersätter 5fC eller 5caC till omodifierade cytosin med base excision repair väg11.
Den mänskliga TET2 -genen identifierades som en ofta muterad gen i olika hematopoietiska maligniteter inklusive myelodysplastiskt syndrom (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferativa neoplasmer ( MDS-MPN), och akut myeloisk leukemi (AML) med ursprung från MDS och MDS-MPN16. Nivåerna av 5hmC ändring i benmärgen DNA är lägre hos patienter med TET2 mutationer jämfört med dem med vildtyp (wt)-TET214. Ett antal grupper har utvecklat TET2-knockout musmodeller för att belysa dess roll i normal blodbildning och myeloisk omvandling17,18,19,20. Dessa möss med mutationer i genen TET2 var initialt normal och lönsamt, men yttrar sig olika hematopoietiska maligniteter som de äldre orsakar deras tidiga död. Dessa studier visade de viktiga roller i wt-TET2 normala hematopoetiska differentiering. I dessa musmodeller, heterozygot hematopoetiska stamceller (TET2+/- Förenta) och homozygot TET2– / – hade Förenta en konkurrensfördel gentemot homozygot wt-TET2 Förenta i återinplantering hematopoetiska härstamningar som båda TET2+/- och TET2– / – Förenta utvecklat olika hematopoietiska maligniteter17,18. Dessa studier visar att haploinsufficiency av TET2 dioxygenas förändrar utvecklingen av Förenta och resulterar i hematopoetiska maligniteter.
Liknar möss med mutationer i genen TET2, de flesta leukemipatienter manifestera haploinsufficiency TET2 dioxygenas verksamhet. Dessa mestadels heterozygot somatiska mutationer inkluderar ram-Skift och nonsens mutationer spridda över hela TET2 gen kroppen medan missense mutationer som är mest klustrade i dioxygenas domän12. Hittills har rapporteras lite karakterisering av wt – och mutant-TET2 i litteraturen främst på grund av svårigheter med produktionen av TET2 dioxygenas och dess analys21. Vi rapporterar här, en enkel steg rening av infödda TET2-dioxygenas använder jonbyteskromatografi. Ytterligare, en kvantitativ LC-MS/MS-analys var optimerad och används för att mäta den enzymatiska aktiviteten av infödda TET2-dioxygenas.
Mutationer i TET2-genen är några av de vanligaste identifierade genetiska förändringarna hos patienter med varierande hematopoetiska maligniteter. Hittills hundratals olika TET2-mutationer, bland annat nonsens, ram-Skift och missense mutationer, har identifierats i patienter12. Patienter med TET2 mutationer uppvisar låga nivåer av genomisk 5hmC i benmärgen jämfört med dem med wt-TET214. Mutant TET2 inpressning experiment har återgetts effekterna …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har finansierats av US-avdelningen av försvar i form av en Idea Award (W81XWH-13-1-0174), aplastisk anemi och MDS Foundation Grant, och UMRB bidrag till M.M. Authors tacka Mohit Jaiswal och Subhradeep Bhar för inledande kloning av TET2 i pDEST14 vektor.
HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
LB Media | Affymetrix | J75852 | |
IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
HPLC | Shimadzu HPLC | ||
XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |