Summary

Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Published: June 06, 2018
doi:

Summary

Пакетная обработка экранов 2-гибрида дрождей позволяет для прямого сравнения профилей взаимодействия нескольких приманки белков с весьма сложным набором добычу синтеза белков. Здесь мы описываем, изысканные методы, новые реагенты и как осуществлять их использования для таких экранов.

Abstract

Скрининг для взаимодействий протеин протеина используя пробирного 2-гибрида дрождей уже давно эффективным средством, но его использование во многом был ограниченным к открытию высокоспецифичные посредники, которые сильно обогащенный в библиотеке взаимодействующих кандидатов. В традиционном формате пробирного 2-гибрида дрождей может принести слишком много колоний для анализа при проведении в низкой жесткости где низкого сродства посредники могут быть найдены. Кроме того без всеобъемлющей и полной допроса той же библиотеки против различных приманки плазмид, сравнительный анализ невозможно. Хотя некоторые из этих проблем могут быть решены с использованием библиотек выстроились добычу, стоимость и инфраструктуры, необходимых для работы таких экранов может быть непомерно высока. В качестве альтернативы, мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, используя стратегию называют DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), который включает в себя высокопроизводительного секвенирования ДНК и вычисление проследить эволюцию популяции плазмиды, которые кодируют взаимодействия партнеров. Здесь мы описываем заказной реагентов и протоколы, которые позволяют DEEPN экрана, чтобы быть выполнен легко и экономически эффективно.

Introduction

Полное понимание биологических процессов клетки основывается на поиске сетей взаимодействия белков, которые лежат в основе их молекулярные механизмы. Один из подходов к идентификации взаимодействий протеина является дрожжи assay (Y2H) 2-гибрид, который работает путем сборки функционирования химерных транскрипционный фактор, после двух доменов протеина интереса связывать друг с другом1. Типичный Y2H экран осуществляется путем создания население дрожжей, что дома обе библиотеки плазмид кодирования взаимодействуя белками, сливается с transcriptional активатор (например., «добычу» синтез белка) и плазмида данного «приманки» состоит из белка из интереса сливается с ДНК связывающий домен (например, Gal4 ДНК-связывающих домен, который связывает вверх по течению Gal4 активируя последовательности). Одним из главных преимуществ Y2H подход является, что это сравнительно легко и недорого провести в типичной лаборатории оснащены для рутинной молекулярных биологических работы2. Однако когда традиционно выполняется, пользователь образцы отдельных колоний, которые возникают при выборе для позитивного взаимодействия Y2H. Это серьезно ограничивает количество библиотека «добычу» клоны, которые могут быть обследованы. Эта проблема усугубляется, когда обилие конкретных взаимодействующих добычу очень высока по сравнению с другими, уменьшая вероятность обнаружения взаимодействия с низкой численности хищных плазмид.

Одним из решений для использования Y2H принципа всеобъемлющего охвата протеома является использование матрицы формате подхода, которой массив плазмид известных индивидуальных добычу могут допрашиваться цифровой. Однако такой подход требует инфраструктуры, которая не является легко доступной или экономически отдельных следователей, которые заинтересованы в определении interactome небольшое количество белков или домены3. Кроме того очень сложные добычу библиотек, которые могут кодировать несколько фрагментов взаимодействующих белков будет расширять размер такой матрицы массивов непрактичным размеров. Альтернативой является для выполнения анализов с комплекс библиотек в пакетах и оценить наличие взаимодействующих клонов, используя массивной параллельной последовательности высок объём4. Это может быть применено к assay присутствие плазмид добычу, которые возникают в несколько колоний, с использованием типичного Y2H формате подход, в котором дрожжи клетки жилья взаимодействующие синтеза белков могут расти на пластине5,6. Эта общая идея может акцентировал увеличить запрос оба несколько приманки и добычей компонентов на же время7,8.

Тем не менее многие расследования требуют что проще еще более целенаправленный характер усилий на нескольких белка «приманки» и может принести пользу более запросом исчерпывающим и полуколичественных единый комплекс добычу библиотеки. Мы разработали и проверены подход для выполнения белка широкомасштабного взаимодействия исследования с использованием Y2H принцип в пакетный формат4. Скорость расширения конкретной жертвой плазмида использует в качестве прокси для относительной силы взаимодействия Y2H9. Глубокие секвенирования всех плазмид в рамках населения подвергается нормальному росту или селективный рост условий производит полную карту клонов, которые дают сильные и слабые Y2H взаимодействий. Репертуар посредники могут получить и непосредственно сравнивать по несколько плазмидов приманки. Полученный рабочий процесс, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей) таким образом может использоваться для определения дифференциального interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, позволяя сравнение одного белка против другой.

Здесь, мы демонстрируем DEEPN и внесения улучшений в лабораторных методов, которые облегчают его использования, которые приводятся на рисунке 1. Значительные усовершенствования включают в себя:

Поколение популяций хищных дрожжи. Одним из ключевых требований DEEPN порождает населения дрожжей с различные приманки плазмиды, которые имеют такое же распределение библиотек добычу плазмиды. Эквивалентные базовых популяций хищных плазмида библиотеки необходимы для точных сопоставлений между interactomes разных приманки. Это лучше всего достигается, когда библиотека плазмида уже расположен в haploid дрожжей населения и перемещение заданного приманки плазмида в населения достигается путем спаривания производить диплоидные. Здесь мы предоставляем четкое руководство в том, как сделать такое население, с использованием коммерческих библиотек, размещенный в haploid дрожжей. Хотя мы нашли методы, которые генерируют большое количество diploids, общей спаривания эффективности эти коммерческие библиотеки, содержащей штаммов дрожжей был низким. Таким образом мы построили новый штамм, который может дом добычу библиотек, что дает гораздо больше diploids за спаривания реакции.

Новый набор приманки плазмид. Многие текущие плазмиды, которые выражают протеины сплавливания «приманки» входят протеина интереса и ДНК связывающих домена на основе 2μ, позволяя им для того усилить их копии номер. Этот номер копии могут быть вполне переменной в населенности и привести к изменчивости в ответ transcriptional Y2H. Это в свою очередь может исказить возможность оценить силу взаимодействия данного белка, основываясь на ответе роста клеток под выбор. Это может быть частично адрес с помощью низкой копировать плазмиду, некоторые из которых ранее были описаны как коммерчески доступных pDEST3210. Мы построили новые приманки плазмида (pTEF ГПБ), которая производит Gal4-ДНК связывающих белков фьюжн домена внутри центромер низкая копирования плазмида TRP1 , перевозящих ген сопротивления Kanr, также позволяет клонирования приманки фрагментов оба вверх по течению и вниз по течению от Gal4 ДНК-связывающих домена.

Библиотека фрагмент новой высокоплотного Y2H. Мы построен новый плазмида дом Y2H добычу библиотек и использовал его для построения сложных Y2H библиотеки из случайно стриженый фрагментов геномной ДНК из Saccharomyces cerevisiae. Анализ последовательности показали, что эта библиотека более 1 миллиона различных элементов, гораздо более сложным, чем ранее описанные дрожжи геномной Y2H плазмиды библиотек11. С этой новой библиотеки мы смогли показать, что процесс DEEPN достаточно прочным для того, чтобы вместить комплекс библиотек с много различных плазмид в манере, которая является надежным и воспроизводимость.

Protocol

1. подготовка средств массовой информации и плиты Примечание: Все пластины должны быть сделаны как минимум 2 дня перед началом протокол. Средства массовой информации могут быть сделаны в любой точке. Однако буферизации дрожжевой экстракт Пептон Декстроза аденин (bYPDA) необх…

Representative Results

Y2H assay широко используется для поиска: протеин взаимодействия и несколько систем и адаптации были разработаны. По большей части те же соображения, которые помогут обеспечить успех этих предыдущих подходов имеют важное значение для DEEPN. Некоторые из важных контрольных ?…

Discussion

Здесь мы предоставляем руководство по как для выполнения анализов Y2H в пакете с помощью оптимизированные методы. Есть несколько критических шаги процедуры, чтобы помочь обеспечить население дрожжей, который будет находиться в разделе выбор представителя начала библиотеки и что доста?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим сотрудников в рамках Института генетики человека для подготовки NGS библиотеки и последовательности. Мы благодарим Эйнат Снир за ее опыт в подготовке геномная библиотека фрагментов для библиотеки плазмида Y2H здесь. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения: низ R21 EB021870-01A1 и NSF исследовательский проект Грант: 1517110.

Materials

Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain Dr. Robert Piper Lab MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  17. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Play Video

Cite This Article
Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

View Video