Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden
Bu makalede
Özet
Özet
Obezite bir geniş yağ dokusu adipocyte hipertrofisi ile öncelikle remodeling tarafından eşlik ediyor. Aşırı adipocyte büyüme insülin, yerel hipoksi ve inflamasyon zavallı bir yanıt sonuçlanır. Tarafından ataları gelen fonksiyonel beyaz adiposit farklılaşma uyarıcı, radikal hipertrofisi adipocyte nüfusun önlenebilir ve sonuç olarak, yağ dokusu metabolik sağlık bir azalma ile birlikte geliştirilebilir iltihap. Ayrıca, bej/kahverengi adiposit bir farklılaşma uyararak, toplam vücut enerji harcaması, kilo kaybına kaynaklanan artırılabilir. Bu yaklaşım obezite komorbiditeler tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişimini engelleyebilir.
Bu kağıt yalıtım, genişleme ve beyaz ve bej adiposit CD31 ve CD34 işaretleri Co hızlı insan yağ dokusu endotel hücre alt grubunu üzerinden farklılaşma açıklanmaktadır. Yöntem nispeten ucuzdur ve emek yoğun değil. İnsan yağ dokusu erişimi gerektirir ve subkutan depo örnekleme için uygundur. Bu iletişim kuralı için taze yağ doku örnekleri morbid obez bir konu [vücut kitle indeksi (VKİ) > 35] Bariatrik cerrahi prosedürler sırasında toplanır. Stromal vasküler kesir üzerinden sıralı bir immunoseparation kullanarak, yeterince hücre gibi 2-3 g yağ küçük üretilmektedir. Bu hücreler kültür-ebilmek var olmak genişlemek 10-14 gün içinde cryopreserved ve geçiş kadar 5-6 passaging ile onların Adipojenik özellikleri korurlar. Hücreleri bir Adipojenik insan insülin bir arada ve PPARγ agonist-rosiglitazone kullanarak kokteyl ile 14 gün için kabul edilir.
Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış yağ endotel hücrelerinde Adipojenik yanıt-e doğru götürmek moleküler mekanizmaları üzerinde kavramı deneyler kanıtı elde etmek için veya Adipojenik artırabilir yeni ilaçlar eleme için yanıt ya beyaz doğru yönetmen ya da bej/kahverengi adipocyte farklılaşma. Küçük subkutan biyopsi kullanarak, Bu metodoloji Yanıtlayıcı olmayan konular için klinik çalışmalarda bej/kahverengi ve beyaz adiposit komorbiditeler ve obezite tedavisi için teşvik etmek amaçlı dışarıda için kullanılabilir.
Giriş
Son kanıtlar hem fareler ve insanlar, yağ dokusu damarlara ikamet eden hücre alt grubunu beyaz veya bej/kahverengi adiposit1,2,3Ayrıştırılan gösterir. Bu tür hücrelerin fenotip tartışmalara, endotel hücreleri, düz kas/pericyte veya ara fenotipleri4,5,6,7bir spektrum destekleyen kanıt ile bir konudur. Bu metodoloji geliştirme kapsam CD34 + CD31 + endotel hücreleri obez insanlar farklı yağ depoları dan izole Adipojenik potansiyelini test etmek için ya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Kurumsal teftiş kurulu Derneği Doğu Virginia Tıp Fakültesi, araştırma ve çalışmada kullanılan insan yağ doku örnekleri toplanması onayladı. Bilinçli yazılı izni hastalardan toplanmıştır.
1. hazırlanması arabellekleri, medya ve aletleri
- Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered çözüm (KRBBS) hazırlamak: 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibasic, 5.5 mM glikoz, 1 mM Adenozin, % 0,01 antibiyotik/antimycotic mix (50 µg/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin, gentamisin 30 µg/mL, amfoterisin 15 ng/mL) ve 10 mM HEPES (pH 7.4 =). Bu çözüm doku toplama ve sindirim için her zaman taze hazırlanır....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bizim iletişim kuralı CD34 + CD31 + insan yağ dokusunun farklı depoları damar hücreleri Adipojenik potansiyelini belirlemek için bir vitro yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Basitleştirilmiş akış diyagramı Şekil 1A
<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + visseral ve subkutan depoları insan yağ dokusunun endotel hücrelerden bir metodoloji sağlamak için bu kağıt odak noktasıdır.
Metodolojisi kemirgenler veya öncelikle teknikleri fluorescently etiketli veya manyetik boncuklar-18, birleştiğinde CD31 antikorları kullanarak dahil insanlar çeşitli vasküler yatak endotel hücrelerinin yalıtım için bildirilmiştir 19 ,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarlar Becky Marquez, klinik Koordinatörü Sentara Bariatric Merkezi, eleme ve açıklanması kabul etmiş hasta süreci ile yardımını kabul etmek istiyorum. Bu araştırma için Anca ö Dobrian R15HL114062 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Büyük Ekipman | |||
| Biyogüvenlik Kabini | Nuaire | nu-425-400 | |
| Hücre Kültürü İnkübatörü | Thermo-Fisher Scientific | 800 DH | |
| Su Banyosu | Forma Scientific | 2568 | Karşılıklı Çalkalayıcı |
| RT-PCR Makinesi | BIO-RAD | CFX96-C1000 | |
| Elektroforez Kutusu | BIO-RAD | Mini PROTEAN 3 Hücreli | |
| Transblot Kutusu | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Hücresi | |
| Elektroforez Güç Kaynağı | BIO-RAD | PowerPac Basic | |
| ELISA Okuyucu | Moleküler Cihazlar | SpectraMax M5 | |
| Blot Reader | LI-COR | Odyssey | Yakın Kızılötesi |
| Soğutmalı Santrifüj | Eppendorf | 5810 R | |
| Masa Üstü Santrifüj | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| Floresan Mikroskop | > Olympus | BX50 | |
| Ters Mikroskop | Nikon | TMS | |
| KRBSS Tampon | |||
| HEPES | Research Products International | H75030 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Kalsiyum klorür dihidrat | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Potasyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Magnezyum sülfat | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sodyum fosfat monobazik monohidrat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Potasyum klorür< / p> | Sigma-Aldrich< / p> | P9333< / p> | |
| Glikoz< / p> | Acros Organics < / p > | 410950010< / p > | |
| Adenozin < / p> | Acros Organics < / p > | 164040250< / p> | |
| Sığır Serum Albümini < / p > | GE Healthcare Bio-Sciences< / p> | SH30574.02< / p> | |
| Penisilin / Streptomisin< / p> | Thermo-Fisher Scientific< / p> | 15070063< / p> | |
| Doku Sindirimi< / strong>< / p> | |||
| 20 mL Şırınga< / p> | Global Medical< > | 67-2020 | |
| Naylon Mesh, 250 ve mikro; m | Sefar | 03-250/50 | |
| Pipetleme İğneleri | Popper | 7934 | |
| İnce Makas | > Güzel Bilim Aletleri | 14058-11 | |
| Doku Forseps | George Tiemann & Co< / p> | 160< / p> | |
| Kollajenaz, Tip I< / p> | Worthington Biyokimyasal< / p> | LS004196< / p> | |
| Petri Kapları, 100 mm < / p> | ABD Bilimsel < | > 5666-4160 < / p> | TC Tedavi Edilmiş< / p> |
| Eppendorf Tüpleri, 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Konik Tüpler, 15 mL | Nest Scientific | 601052 | |
| Konik Tüpler, 50 mL | Nalgene | 3119-0050 | |
| Sintilasyon Şişeleri | Kimble | 74505-20 | Doku Doğrama |
| Hücre İzolasyonu | |||
| Cellometer | Nexcelom | Auto 2000 | |
| Cellometer Slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| Cellometer Canlılık Boyası | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Akridin Portakal/Propidin yum İyot |
| Anti-CD34 Manyetik Boncuklar | StemCell Teknolojileri | 18056 | Kit |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| Anti-CD31 Plastik Boncuklar | pluriSelect USA | 19-03100-10 | |
| pluriSelect 10x Yıkama Tamponu | pluriSelect USA | 60-00080-10 | |
| pluriSelect Bağlantı Halkası | pluriSelect USA | 41-50000-03 | |
| pluriSelect Ayırma Arabelleği | pluriSelect USA | 60-00046-12 | |
| pluriSelect Kuluçka Tamponu | pluriSelect USA | 60-00060-12 | |
| pluriSelect S Hücre Süzgeci | pluriSelect USA | 43-50030-03 | |
| Cell Culture | |||
| 6 oyuklu Plakalar | USA Scientific | CC7682-7506 | TC Tedavi Edilmiş |
| 4- iyi odacıklı slaytlar | Corning Life Sciences | 354559 | Fibronektin kaplı |
| 4 kuyulu odacıklı slaytlar | Thermo-Fisher Scientific | 154526PK | Kaplamasız cam |
| İnsan Yağ Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HAMVEC) | Sciencell Araştırma Laboratuvarları | 7200 | Birincil hücre hattı |
| Endotel Hücre Ortamı (ECM) | ScienCell Araştırma Laboratuvarları | 1001 | Komple Kit |
| DMEM/F12 Bazal Ortam | Thermo-Fisher Scientific | 11320082 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Rocky Mountain Biologicals | FBS-BBT | |
| İnsülin | Lilly | > U-100 | Humalog |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Cell Analysis | |||
| Oil Red O Dye | Sigma-Aldrich | O0625 | İzopropanol içinde hazırlanmıştır |
| 96 kuyulu plakalar | USA Scientific | 1837-9600 | |
| 96 kuyu PCR plakaları | Genesee Scientific | 24-300 | |
| RNA Ekstraksiyonu | Zymo Research | > R2072 | > Kit |
| cDNA Sentezi | BIO-RAD | 1708841 | Supermix |
| JumpStart PCR Polimeraz | Sigma-Aldrich | D9307-250UN | PCR |
| Magnezyum Klorür Çözeltisi | Sigma-Aldrich | M8787-5ML | PCR reaksiyonunda 3 mM final |
| dNTPs | Promega | U1515 | |
| TaqMan AdipoQ | Thermo-Fisher Scientific | Hs00605917_m1 | |
| TaqMan CIDEA | Thermo-Fisher Scientific | Hs00154455_m1 | |
| TaqMan RPL27 | Thermo-Fisher Scientific | Hs03044961_g1 | |
| TaqMan UCP1 | Thermo-Fisher Scientific | Hs00222453_m1 | |
| BCA Testi | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | Kit |
| Bis-akrilamid | BIO-RAD | 1610146 | 40% stok solüsyonu |
| Amonyum Persülfat | BIO-RAD | 1610700 | |
| TEMED | BIO-RAD | 1610800 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Glisin | BIO-RAD | 1610718 | |
| Sodyum Dodecal Sülfat | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-100 | |
| Bromofenol Mavisi | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| Blot Membran | EMD Millipore | IPFL00010 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A452-SK4 | |
| Odyssey Engelleme Tamponu, Tris | LI-COR | 927-50000 | |
| < p>Anti-AKT antikoru | Hücre Sinyal Teknolojisi | 2920S | Fare monoklonal |
| Anti-pAKT antikoru | Hücre Sinyal Teknolojisi | 9271S < | p>Tavşan poliklonal |
| Anti-UCP1 antikoru | Abcam | ab10983 | Tavşan poliklonal |
| Anti-Fare IgG antikoru | LI-COR | 926-68070 | Keçi Poliklonal, IRDye 680RD |
| Anti-Tavşan IgG antikoru | LI-COR | 926-32211 | 2>< |
| > < | Jackson ImmunoResearch< > | 111-025-003 | Keçi Poliklonal, TRITC |
| Fosfat Tampon Salin | Thermo-Fisher Scientific | 10010049 | |
| 37% Formaldehit Çözeltisi | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 15686 | hücre fiksasyonu için 4% çözelti |
| Normal Keçi Serumu | Vektör Laboratuvarları | S-1000 | 10% engelleme çözümü |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | 0. % 1 geçirgenlik çözeltisi< / p> |
| DAPI< / p> | Thermo-Fisher Scientific< > | D1306 | |
| Calcein | Thermo-Fisher Scientific | 65-0853-39 | Hücre floresan görselleştirme |
| Matrigel Temel Membran Matrisi | Corning Life Sciences | 356231 | Büyüme faktörü azaltıldı |
| DiI etiketli Asetillenmiş LDL | Thermo-Fisher Scientific | L3484 |
Kaynaklar
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metaboli....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
