Con el objetivo de entender el comportamiento de los distintos elementos de ADN conjugativos bacterianos bajo condiciones diferentes, se describe un protocolo para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación, con alta resolución, para estimar cómo eficazmente la bacteria donante inicia verbal.
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Artículo de método
Alta resolución comparación de frecuencias de la conjugación bacteriana
En este artículo
Resumen
Resumen
Conjugación bacteriana es un paso importante en la transferencia horizontal de genes de resistencia a los antibióticos a través de un elemento de DNA conjugativos. Profundidad comparaciones de frecuencia verbal bajo diferentes condiciones se requieren para entender cómo se propaga el elemento conjugativos en la naturaleza. Sin embargo, los métodos convencionales para comparar frecuencia de conjugación no son apropiados para comparaciones de profundidad debido al alta fondo causado por la ocurrencia de eventos verbal adicional en la placa selectiva. Hemos reducido con éxito el fondo introduciendo un método número más probable de (proveedores médicos MPN) y una mayor concentración de antibióticos para prevenir la conjugación en medio líquido selectivo. Además, hemos desarrollado un protocolo para estimar la probabilidad de cómo a menudo donantes las células iniciar verbal por clasificar las células donantes solo en piscinas de receptores por célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación. Uso de dos plásmidos, pBP136 y pCAR1, las diferencias en la frecuencia de conjugación en las células de Pseudomonas putida podrían detectarse en medio líquido a diferentes velocidades de agitación. Las frecuencias de iniciación verbal eran más altas para pBP136 que para pCAR1. Con estos resultados, podemos comprender mejor las características de la conjugación de estos dos plásmidos.
Introducción
Conjugación bacteriana de plásmidos conjugativos y elementos genéticos móviles y elementos conjugativos e integrativo (CIEM) es importante para la diseminación horizontal de información genética. Puede promover la adaptación y evolución bacteriana rápida y transmitir genes de multirresistencia1,2. La frecuencia de conjugación puede verse afectada por las proteínas codificadas en los elementos conjugativos para movilización de ADN (MOB) y acoplamiento par formación (MPF), incluyendo el pili sexual, que se clasifica según MOB y MPF tipo3,4, <....
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Protocolo
1. preparación de un donante con proteína verde fluorescente (GFP)-kanamicina resistencia Gene-Tagged plásmidos y
- Introducción de genes marcadores en el pBP136 del plásmido objetivo
Nota: El objetivo de este protocolo es generar pBP136::gfp. Las cepas de bacterias y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla 1.- Crecen cultivos de Escherichia coli DH10B albergar pBP13617 en 5 mL de caldo Luria estéril (LB) y e. coli S17 1λpir18 que pJBA2819 [que contiene un kanamici....
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Resultados
Comparación de la frecuencia de conjugación por el método MPN
En nuestro informe anterior, se compararon las frecuencias de la conjugación del pBP136::gfp y pCAR1::gfp en triple diluido medio líquido LB (1/3 LB) con diferentes velocidades de agitación después de un apareamiento de 45 min con 125 mL spinner frascos10. Se compararon las frecuencias de la conjugación del pBP136::gfp y.......
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Discusión
Aquí, presentamos un protocolo de alta resolución para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación bajo diferentes condiciones, utilizando un método MPN para estimar el número de transconjugants. Un paso importante en el protocolo es diluir la mezcla de donante y receptor después de aparearse hasta que no transconjugants crecen. Otro paso es añadiendo altas concentraciones de antibióticos en el medio líquido selectivo para evitar más verbal. Estos procedimientos pueden reducir el fondo causado por la conj.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. K. Kamachi de Instituto Nacional de enfermedades infecciosas (Japón) para proporcionar pBP136 y Prof. Dr. H. Nojiri de la Universidad de Tokio (Japón) para proporcionar pCAR1. También agradecemos al profesor Dr. Molin Sølen de la Universidad técnica de Dinamarca para proporcionar pJBA28. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI JSPS (números de concesión 15H 05618 y 15KK0278) para MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Solución de vaina |
| Fluorosferas (10 μ m) | Beckman-Coulter | 6605359 | cuentas para configurar la incubadora FACS |
| Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | ||
| Espectrofotómetro UV-VIS UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| placas de 96 pocillos | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| tipo microplaca Placa de Petri | AXEL | 1-9668-01 | para la validación de la clasificación |
| filtro de membrana | ADVANTEC | C045A025A | para pipetas de acoplamiento de filtros |
| Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ | |
| L pipetas multicanal | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L |
| Triptona | BD Difco | 211705 | |
| Extracto de levadura | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicina | Wako | 185-01003 | |
| gentamicina | Wako | 077-02974 | |
| kanamicina | Wako | 115-00342 | |
| Placa de Petri | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubos | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL matraz giratorio desechable | Corning | CLS3578 |
Referencias
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what th....
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Reimpresiones y permisos
