ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים
Summary
הטיהור של תעלות יונים היא לעתים קרובות מאתגרת, אבל ברגע מושגת, זה יכול העלול לאפשר במבחנה חקירות פונקציות ומבנים של הערוצים. כאן, אנו מתארים את נהלי stepwise הביטוי ואת טיהור bestrophin בתרבית של חלבונים, משפחה של Ca2 +-הפעלת ערוצי Cl– .
Abstract
הגנום האנושי מקודד ארבע paralogs bestrophin, כלומר BEST1, BEST2, BEST3 ו BEST4. BEST1, מקודדת על ידי הגן BEST1 , היא Ca2 +-מופעל Cl– ערוץ (CaCC) המתבטא בעיקר אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). החשיבות פיזיולוגיים ופתולוגיים של BEST1 מודגש על ידי העובדה כי מעל 200 מוטציות שונות בגן BEST1 קושרו מבחינה גנטית לקשת של פחות חמישה הפרעות ניווניות ברשתית, כמו vitelliform הטוב ביותר ניוון מקולרי (מחלת הטובה ביותר). לכן, הבנת את ביופיזיקה של ערוצי bestrophin ברמת מולקולה בודדת בעל חשיבות עליונה. עם זאת, קבלת תעלות יונים יונקים מטוהרים מהווה לעיתים קרובות משימה מאתגרת. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול עבור הביטוי של bestrophin בתרבית של חלבונים עם מערכת העברת גנים baculovirus BacMam וטיהור שלהם על ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. החלבונים מטוהרים יש פוטנציאל להיות מנוצל עוקבות ניתוחים פונקציונליים ומבניים, כגון הקלטה אלקטרופיזיולוגיות השומנים bilayers ו קריסטלוגרפיה. חשוב לציין, צינור זה ניתן להתאים ללמוד את פונקציות והמבנים של תעלות יונים אחרים.
Introduction
Bestrophins הם משפחה של תעלות יונים והתפאורה דרך מינים שונים של חיידקים בני אדם1. בבני אדם, הגן BEST1 הממוקם על כרומוזום 11q12.3, מקודד חלבון הממברנה Bestrophin-1 (BEST1) מתבטאת בעיקר קרום basolateral של הפיגמנט ברשתית תאי אפיתל (RPE) של העיניים2,3 ,4. מורכבת של חומצות אמינו 585, הראשון ~ 350 מהם מאוד נשמרים בין המינים ומכילים את אזור transmembrane, BEST1 משמש CaCC בני האדם-1,–5,–6. יתר על כן, את homologs BEST1 בעופות וגם קלבסיאלה pneumoniae לפעול homopentamers7,8, מציע רמה גבוהה של שימור לאורך כל האבולוציה.
בבני אדם, מעל 200 מוטציות בגן BEST1 קלינית קושרו לקבוצה של מחלות ניוון רשתית הנקראת bestrophinopathies1,9. דווחו חמש bestrophinopathies ספציפיים, כולל מחלת הטוב ביותר, ניוון שרירים בגיל מבוגר vitelliform, vitreoretinochoroidopathy אוטוזומלית דומיננטית, אוטוזומלית bestrophinopathy רצסיבי רטיניטיס פיגמנטוזה3,4 ,10,11,12,13,14. מחלות אלו, אשר להוביל ירד ראייה ועיוורון אפילו, הם כיום חשוכת. על מנת לפתח טיפולים רפואיים ותרופות פוטנציאל אישי, זה קריטי להבין כמה מוטציות גורמי מחלות אלה BEST1 להשפיע על תפקוד ומבנה של ערוץ BEST115. לענין זה, חוקרים צריך להשיג את ערוצי bestrophin מטוהרים (פראי סוג ו/או חשבונאי) ולנהל במבחנה ניתוחים5,8.
הצעד הראשון מפתח היא הביטוי של bestrophin ערוצים מכל המינים העליונים בתאי יונקים. התמרה חושית baculovirus של תאים HEK293-F (מערכת BacMam) היא שיטה חזקה לבטא heterologously קרום חלבונים16,17, פרוטוקול זה מנצל וקטור BacMam אופטימיזציה (pEG BacMam) לביטוי חזקים של יעד חלבון18, אשר במקרה הזה הוא homolog bestrophin יונקים. וקטור זה שימש עבור הביטוי של קרום חלבונים שונים, כולל G-חלבון בשילוב קולטנים, רצפטורים גרעיניים אחרים יון ערוצי18. יש גם ראיות כי החלבונים המיוצרים מתאימים קריסטלוגרפיה18. עם רמות גבוהות של הביטוי בתאים HEK293-F, החלבונים ואז יטוהר באמצעות כרומטוגרפיה; באופן ספציפי, במקרה של bestrophins, זיקה וגם גודל הוצאת גזים יכול לשמש.
לאחר פרוטוקול זה הוא מכויל עבור ערוץ bestrophin, חלבון מטוהרים ניתן ואז לנתח אותם עבור הפונקציה שלה מבנה דרך מישורי ליפידית, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בהתאמה5,8. בסך הכל, שיטות אלה מספקים צינור חזק חקירות פונקציונלי ומבניים של bestrophins, תעלות יונים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר צינור שימושי עבור הביטוי ולטיהור bestrophin בתרבית של תעלות יונים שישמש עבור ניתוחים עתידיים במבחנה . בעוד המכשיר FPLC נדרש עבור גודל-הדרה כרומטוגרפיה, מזרק משאבה מספיקה עבור כל השלבים של כרומטוגרפיית זיקה כולל איגוד, שטיפה ו- eluting. בעת שימוש משאבת מזרק כדי לדחוף פתרונות (מזר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ’סטר סטארט-אפ מימון.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
