Method Article

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

DOI:

10.3791/57847

⸱

June 6th, 2018

 , 
1Department of Biology, Indiana University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد اليرقات المورفولوجية لتحليل GC-MS-تعتمد metabolomic.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أنشأت التطورات الأخيرة في هذا مجال جميع ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية كنموذج وراثية قوية لدراسة الأيض الحيواني. عن طريق الجمع بين مجموعة واسعة من أدوات المورفولوجية الوراثية مع القدرة على مسح مساحات كبيرة من الأيض الوسيطة، يمكن أن تكشف عن نهج جميع التفاعلات المعقدة بين النظام الغذائي والوراثي وتاريخ حياة الأحداث ومنبهات بيئية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اكتشاف الآليات الانزيمية رواية جميع الدراسات وكشف اتصالات مجهولة بين المسارات الأيضية التي تبدو متباينة. من أجل تيسير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا مجتمع المورفولوجية ، هنا نقدم بروتوكول تفصيلية التي توضح هذه المقالة كيفية إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)- على أساس تحليل metabolomic. لدينا بروتوكول يتضمن وصفاً لجمع العينات اليرقات واستخراج المستقلب، derivatization الكيميائية وتحليل GC-MS. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول سوف تسمح للمستخدمين لقياس الوفرة النسبية لنواتج الأيض القطبية الصغيرة، بما في ذلك الأحماض الأمينية والسكريات والأحماض العضوية تشارك في دورات TCA وتحلل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية برز كنظام مثالي لدراسة الآلية الجزيئية التي تنظم الأيض الوسيطة. ليس فقط هي حفظت معظم الأيضية بين البشر و المورفولوجية ، ولكن أجهزة الاستشعار المغذيات الرئيسية ومنظمات النمو، مثل الأنسولين، تور، وحركة، تنشط أيضا في أن يطير1،2. كنتيجة لذلك، يمكن استخدام المورفولوجية لاستكشاف الأساس الأيضي للأمراض البشرية تتراوح بين مرض السكري والسمنة نيوروديجينيريشن والسرطان. وفي هذا الصدد، وضع اليرقات المورفولوجية يوفر الإطار المثالي لدراسة برنامج الاستقلابية المعروفة بتحلل الهوائية، أو تأثير واربورغ. تماما كما استخدم العديد من الأورام تحلل الهوائية لتو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جمع البيض

  1. جمع البالغين من الذكور والإناث العذراء من الأنماط الجينية المنشودة. على حدة في سن هذه الحيوانات في قنينة غذاء مع وسائل الإعلام بلومينغتون القياسية لمدة 3 – 5 أيام.
  2. إعداد ماتينجس المناسبة عن طريق نقل 50 العذراء الإناث والذكور 25 إلى قنينة أغذية جديدة.
    ملاحظة: ينبغي إعداد الحد أدنى من ستة ماتينجس مستقلة لكل الوراثي. وسيتم جمع عينة واحدة فقط من كل التزاوج (أي ست عينات جمعت من ست ماتينجس المستقلة).
  3. إعداد قبعات وضع البيض دبس السكر.
    1. مزيج من 115 مل من دبس السكر وز 29 من أجار مع 700 مل ح2س في قارورة 2 ل.
    2. يغلي دبس السكر الخليط أجار على طبق ساخن.
    3. كول إلى 70 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاكتات نازعة المسوخ (دلده)، والتي تفتقر إلى النشاط دلده4، وعناصر مطابقة وراثيا وجمعت يرقات منتصف L2 وتجهيزها وفقا للبروتوكول المذكورة أعلاه. عند مقارنة مع عناصر التحكم، اليرقات متحولة يحمل تغييرات كبيرة في لاكتات، بيروفات ول-2-هيدروكسيجلوتاراتي4. تم اقتناء الأطياف مع نظام اجيلنت GC6890-5973i مرض التصلب العصبي المتعدد. مثال من أطياف GC-MS تولد مع لدينا بروتوكول ويرد في الشكل 1. وهناك العديد من الميزات ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع يوفر فرصة لا مثيل لها لدراسة التفاعلات الأيضية التي تؤلف أيض وسيطة. الحساسية لهذه التكنولوجيا، ومع ذلك، يجعل البيانات عرضه للخلفية الوراثية والعظة التنموية، ومجموعة متنوعة من الضغوط البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، والرطوبة، والكثافة السكانية، وتوافر المغذيات. ولذلك، عالية يتطلب تحليل جميع الجودة واستنساخه بجمع العينات تحت ظروف خاضعة للرقابة عاليا. بينما تؤكد عدة ملاحظات على هذه النقطة3،،من823، هنا نقدم أسلوب خطوة بخطوة لج.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وبفضل الأعضاء في مرفق مطيافية الكتلة جامعة إنديانا وجامعة يوتا جميع مرفق الأساسية للمساعدة في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول. J.M.T. معتمد من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R35GM119557.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
دبس السكر الأسود غير الكبريتGood Food ، INC
ذبابة الفاكهة أجار النوع الثانيجينيسي العلمي66-103
بيريدينEMD ميليبورPX2012-7
ميثوكسيأمين هيدروكولوريد (موكس)MP Biomedicals، LLC155405
MSTFA مع 1٪ ثلاثي ميثيل كلوروسيلانسيجما69478
فليشمان s الخميرة الجافة النشطةAB Mauri Food Inc2192
6 أوقية ذبابة الفاكهة زجاجةمخزون جينيسي العلمية32-130
مزيج تجانس الأنسجة الرخوة (2 مل أنابيب)   ؛Omni InternationalSKU: 19-627
إدراج قارورة ، 250 & micro ؛ L الزجاج المعطلة مع أقدام البوليمرAgilent5181-8872
حمض السكسينيك-2،2،3،3-d4< / sub>Sigma293075
SpeedVacThermo  SC210A
o-phosphoricacid Fisher ScientificA242-1
حمض البروبيونيكSigmaP5561
p-Hydroxy حمض البنزويك ميثيل استرGenesee Scientific20-258
Bead RuptorOmni InternationalSKU:19-040E
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000012
شاكر MultiTherm مع كتلة 24 × 12 مممعياري ScientificH5000
MethanolSigma34860
1.5 مل أنبوب طرد مركزيEppendorf22364111
Falcon 35 × 10 مم طبق زراعةالأنسجة Corning Incorporated353001
عمود GCPhenomexZB-5MSi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
  2. Sieber, M. H., Spradling, A. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Larval SamplesGC MS MetabolomicsMetabolite ExtractionChemical DerivatizationBead Mill HomogenizationVacuum CentrifugationMethoxylamine DerivatizationMSTFA SilylationAutosampler Vial PreparationPrinciple Component Analysis

Related Articles