एक न्यूक्लियोटाइड विस्तार और मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग कर ठीक करना और डीएनए मरंमत परख
Summary
डीएनए पोलीमरेज़ ठीक करने के लिए एक गैर-लेबल, गैर-रेडियो-isotopic विधि और एक डीएनए रिपेयर की परख उच्च संकल्प मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार रणनीति का उपयोग करके विकसित किया गया था । परख के लिए बहुत विशिष्ट, सरल, तेजी से साबित कर दिया है, और आसान ठीक करने के लिए प्रदर्शन और मरंमत 9 से कम पैच-न्यूक्लियोटाइड ।
Abstract
जीनोम और उसके वफादार प्रतिकृति के रखरखाव आनुवंशिक जानकारी के संरक्षण के लिए सर्वोपरि है । उच्च निष्ठा प्रतिकृति का आकलन करने के लिए, हम एक सरल गैर लेबल और गैर-रेडियो-isotopic विधि का उपयोग कर एक मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization समय की उड़ान के साथ (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के लिए एक ठीक अध्ययन के लिए विकसित किया है । यहां, एक डीएनए पोलीमरेज़ [उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में ई कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं (पोल मैं) के Klenow टुकड़ा (KF) सभी चार dideoxyribonucleotide triphosphates की उपस्थिति में एक बेमेल प्राइमर-टेंपलेट द्वैध प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है । बेमेल प्राइमर तो है ठीक/विस्तारित और मालदी-तोफ एमएस के अधीन । उत्पादों के एक न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों के लिए नीचे प्राइमर के बड़े पैमाने पर परिवर्तन द्वारा प्रतिष्ठित हैं । महत्वपूर्ण बात, एक ठीक भी आंतरिक एकल बेमेल के लिए निर्धारित किया जा सकता है, हालांकि अलग क्षमता पर । बेमेल 2-4 पर स्थित-न्यूक्लियोटाइड (nt) से 3 ‘ अंत में मैं पॉल द्वारा कुशलतापूर्वक ठीक कर रहे थे, और 5 nt में एक बेमेल प्राइमर टर्मिनस से केवल एक आंशिक सुधार दिखाया । प्राइमरी 3 ‘ अंत से 6-9 nt पर स्थित आंतरिक बेमेल के लिए कोई ठीक नहीं हुई । इस विधि भी डीएनए मरंमत परख के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, इंडो वी मरंमत मार्ग के लिए सब्सट्रेट्स के एक आधार घाव की मरंमत का आकलन) । 3 ‘ अंत deoxyinosine (डि) घावों युक्त प्राइमरों मैं पॉल द्वारा ठीक किया जा सकता है । दरअसल, अंत टी आई, जी मैं, और एक-मैं सब्सट्रेट उनके पिछले 2 dI-युक्त न्यूक्लियोटाइड मैं एक सही ddN 5 ‘-मोनोफोस्फेट (ddNMP), जबकि अंत सी मैं बेमेल मैं पॉल द्वारा सहन किया गया था जोड़ने से पहले मैं, की अनुमति प्राइमर के बिना बढ़ाया जा रहा था मरंमत, संवेदनशीलता और एमएस परख के लिए डीएनए मरंमत के उपाय के संकल्प का प्रदर्शन ।
Introduction
डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए polymerases की ठीक कार्य आनुवंशिक जानकारी है कि संतान को हस्तांतरित करने की जरूरत के उच्च निष्ठा सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है1,2,3,4, 5,6,7. पोलीमरेज़ ठीक exonucleases के योगदान का आकलन करने में सक्षम होने के नाते आनुवंशिक स्थिरता की सुरक्षा तंत्र स्पष्ट होगा ।
रेडियो आइसोटोप लेबलिंग और जेल-आधारित परख densitometric विश्लेषण के साथ संयोजन में autoradiograms या फास्फोरस इमेजिंग8,9,10 पारंपरिक रूप से डीएनए की गतिविधि को ठीक करने का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है polymerases । जबकि कार्यात्मक, इन परख श्रमसाध्य, महंगी हैं, और उच्च प्रवाह प्रारूपों के लिए उत्तरदाई नहीं है । इसके अलावा, radioisotopes अपशिष्ट निपटान सहित सुरक्षा के मुद्दों को भुगतना । वैकल्पिक रूप से, ठीक गतिविधियों fluorometric तकनीकों द्वारा विश्लेषण किया गया है । उदाहरण के लिए, 2-aminopurine (2-एपी) में इन विट्रो पोलीमरेज़ एक फ्लोरोसेंट संकेत11,12का उत्पादन करने के लिए परख ठीक करने के दौरान विस्तार उत्पादों में शामिल किया जा सकता है । दुर्भाग्य से, इन दृष्टिकोण एक कम विशिष्टता से ग्रस्त हैं, के बाद से 2-एपी दोनों thymine और cytosine के साथ जोड़ी कर सकते हैं । अधिक हाल के दृष्टिकोण एक संवेदनशील जी quadruplex-आधारित luminescent स्विच-जांच पर एक पोलीमरेज़ 3 ‘-5 ‘ exonuclease परख13 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक पोलीमरेज़ ठीक परख है कि कुछ पर काबू के लिए एक अकेले लेबल फ्लोरोसेंट जांच के रूप में शामिल aforementioned कमियां14। इन fluorometric तरीकों के लिए उत्साह डीएनए सब्सट्रेट के विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता के कारण कम है ।
इसके विपरीत, डीएनए विश्लेषण के लिए एक मालदी-तोफ एमएस में नियोजित किया गया है, जहां लेबल के साथ प्राइमर विस्तार प्रतिक्रियाओं 4 ddNTPs एक दिया लोकस15,16,17 में बहुरूपताओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और व्यापक रूप से उत्परिवर्तन का पता लगाने और कैंसर के निदान के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों में अपनाया गया है18। इन बुनियादी सिद्धांतों का प्रयोग, हम एक लेबल के लिए नि: शुल्क परख बनाया है इन विट्रो में डीएनए का निर्धारण पोलीमरेज़ को ठीक करने के उच्च संकल्प, उच्च विशिष्टता, और उच्च प्रवाह क्षमता का दोहन मालदी-तोफ MS. E का उपयोग कर गतिविधि । कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ मैं एक मॉडल एंजाइम के रूप में टुकड़ा Klenow, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) सब्सट्रेट के रूप में न्यूक्लियोटाइड-तोफ MS (चित्रा 1) के माध्यम से एक एकल मालदी विस्तार के बाद उत्पादों को ठीक करने का एक “स्नैपशॉट” ले सकते हैं ।
इसी तरह, इस विधि भी एक डीएनए की मरंमत परख जहां 3 ‘ अंत dI घावों युक्त प्राइमरों के लिए विकसित किया गया एक पोल मैं परख जो इंडो V निक मरंमत मध्यवर्ती नकल की मरंमत के अधीन हैं । हालांकि पूरी तरह से समझ में नहीं, इंडो वी मरंमत मार्ग ही मरंमत के लिए पॉल मैं घाव के लिए exonuclease गतिविधि ठीक करना काम ज्ञात प्रणाली है19,20। मालदी का प्रयोग-तोफ एमएस, हम एक स्पष्ट रूप से परिभाषित मरंमत पैच दिखाने जहां dI पॉल द्वारा उत्पादेड किया जा सकता है मैं जब सही पूरित न्यूक्लियोटाइड जोड़ने से पहले प्राइमर के पिछले 2 nt में होने वाली ।
ठीक करने और डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए, इस विधि तेजी से और पिछले तरीकों की तुलना में कम श्रमसाध्य है और तंत्र और समारोह के प्रति अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह अध्ययन एक कदम दर कदम ठीक वर्णित गतिविधि परख चुना वाणिज्यिक उपकरण द्वारा विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग मालदी-तोफ MS । प्रमुख लाभ शामिल है कि प्राइमर और टेम्पलेट लेबल स्वतंत्र और प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कार्यात्मक जीनोमिक्स (ताइपे, ताइवान) और उनके तकनीकी समर्थन के लिए NRPB Pharmacogenomics लैब (ताइपे, ताइवान) के लिए NCFPB एकीकृत कोर सुविधा का धंयवाद । इस काम के लिए ताइवान हेल्थ फाउंडेशन (एल आई ए से अनुसंधान अनुदान का समर्थन किया गया. एल) और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइपे, ताइवान, ROC [सबसे 105-2320-b-002-047] वी के लिए-याओ हू, [सबसे 105-2628-b-002 -051-MY3] कांग के लिए यी र, और [ सर्वाधिक-105-2320-B-002-051-MY3] for लिआंग-In Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
