Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.
Summary
En icke-märkt, icke-radio-isotopiska metod för DNA-polymeras korrekturläsning och en DNA reparation analys utvecklades med hjälp av högupplösta MALDI-TOF masspektrometri och en enda nukleotid förlängning strategi. Analysen visade sig vara mycket specifika, enkel, snabb och lätt att utföra för korrekturläsning och reparera patchar kortare än 9-nukleotider.
Abstract
Underhåll av genomet och dess trogna replikering är avgörande för att bevara genetisk information. För att bedöma HiFi replikering, vi har utvecklat en enkel icke-märkt och icke-radio-isotopiska metoden använder en matris-assisted laser desorption jonisering med time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) analys för en korrekturläsning studie. Här, en DNA-polymerase [t.ex. Klenow fragmentet (KF) av Escherichia coli DNA-polymerase jag (pol jag) i denna studie] i närvaro av alla fyra dideoxyribonucleotide-trifosfater används för att bearbeta en omaka primer-mall duplex. Felmatchade primern är sedan korrekturläsa och utökade och utsätts för MALDI-TOF MS. Produkterna kännetecknas av massa ändringen av primern ner till enda nukleotid variationer. Ännu viktigare, kan en korrekturläsning också bestämmas för interna enda missmatchningar, om än vid olika effektivitetsvinster. Missmatchningar ligger på 2-4-nukleotider (nt) från 3′ slutet var effektivt korrekturläsa av pol jag, och en obalans på 5 nt från primer slutstationen visade endast en delvis korrigering. Ingen korrekturläsning uppstod för interna oförenligheter ligger på 6-9 nt från primer 3′ slutet. Denna metod kan också tillämpas på DNA reparation analyser (t.ex. bedömningen av en base-lesion reparation av substrat för endo V reparation vägen). Primers som innehåller 3′ näst sista deoxyinosine (dI) lesioner kan rättas av pol jag. Ja, näst sista T-I, G-I, och A-jag substrat hade sin sista 2 dI-innehållande nukleotider censurerade av pol jag innan du lägger till en rätt ddN 5′-monofosfat (ddNMP) medan näst sista C-jag missmatchningar tolererades av pol I, så att primern förlängas utan reparation, visar känslighet och upplösning av MS test för att mäta DNA-reparation.
Introduction
DNA-polymerases under DNA-replikation korrekturläsning funktioner är avgörande för hög trohet av genetisk information som behöver överföras till avkomman1,2,3,4, 5,6,7. Att kunna bedöma bidragen av polymeras korrekturläsning exonucleases skulle klargöra mekanismerna skydda genetiska stabilitet.
Radioisotop märkning och gel-baserade analyser i kombination med Densitometrisk analyser av autoradiograms eller fosfor imaging8,9,10 har traditionellt använts för att upptäcka korrekturläsning aktivitet av DNA polymeraser. Medan funktionell, finns dessa analyser mödosamma, dyra och inte mottaglig för hög genomströmning format. Dessutom lider radioisotoper säkerhetsfrågor inklusive bortskaffande av avfall. Alternativt, korrekturläsning aktiviteter har analyserats av fluorometric tekniker. 2-aminopurine (2-AP) kan exempelvis ingå i tillägget produkter under in vitro- polymeras korrekturläsning analyser för att producera en fluorescerande signal11,12. Tyvärr lider dessa synsätt en låg specificitet, eftersom 2-AP kan parkoppla med både tymin och cytosin. Nyare metoder innehålla en känslig G-quadruplex-baserade självlysande påsättning sond för ett polymeras 3′ – 5′ exonuclease assay13 samt en ensamma-märkt fluorescerande sond för ett polymeras korrekturläsning analys som övervinner några av de ovan nämnda nackdelarna14. Entusiasm för dessa fluorometric metoder minskas på grund av behovet av särskilda märkning av DNA substrat.
Däremot en MALDI-TOF MS för DNA-analys har varit anställd i PinPoint-analysen, där primer filändelsen reaktionerna med omärkt 4 ddNTPs kan användas för att identifiera polymorfismer vid en viss locus15,16,17 och allmänt har antagits i kliniska tillämpningar för mutation upptäckter och cancer diagnoser18. Med dessa grundläggande principer, har vi skapat en etikett-gratis test för in vitro- bestämning av DNA-polymeras korrekturläsning aktivitet som utnyttjar hög upplösning, hög specificitet och hög genomströmning potential av MALDI-TOF MS. med E. coli DNA-polymeras som jag Klenow fragmentet som en modell enzym, dideoxyribonucleotide trifosfater (ddNTPs) som substrat kan ta en ”ögonblicksbild” av korrekturläsning produkter efter en enda nukleotid förlängning via MALDI-TOF MS (bild 1).
Likaså utvecklades denna metod också för en DNA reparation analys där primers innehållande 3′ näst sista dI lesioner utsätts för en pol jag reparera assay som härmar endo V nicked reparation intermediärer. Medan inte helt klarlagda, är endo V reparation stigen bara reparera systemet känt att anställa pol jag korrekturläsning exonuclease aktivitet för lesionen excision19,20. Använda MALDI-TOF MS, vi visar en klart definierad lagningslapp där dI kan vara censurerade av pol I när som förekommer i de sista 2 nt av primer innan du lägger den rätta kompletteras nukleotid.
För att studera korrekturläsning och DNA-reparation, denna metod är snabbare och mindre arbetskrävande än tidigare metoder och ger ytterligare information mot mekanism och funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie beskrivs en steg för steg korrekturläsning aktivitet assay analyseras av valda kommersiella instrumentet (se Tabell för material) med MALDI-TOF MS. De stora fördelarna inkluderar att primer och mallen är etikett gratis och enkelt att utföra, vilket möjliggör större flexibilitet i utformningen av experiment. En ström-lime komplett bearbetning av 30 korrekturläsning tester skulle ta 4 h, inklusive 3 h för att manuellt utföra korrekturläsning reaktionerna och deras rensning, medan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar de NCFPB integrerade Core Facility för funktionell genomik (Taipei, Taiwan) och NRPB farmakogenomik Lab (Taipei, Taiwan) för deras tekniska support. Detta arbete stöds av forskningsanslag från stiftelsen Taiwan hälsa (L-I.L.) och ministeriet för vetenskap och teknik, Taipei, Taiwan, ROC [mest 105-2320-B-002-047] för Wei-Yao Hu, [mest 105-2628-B-002-051-MY3] för Kang-Yi Su och [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] för Liang-i Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
