Стереотаксическая приемных передачи цитотоксических иммунокомпетентных клеток в мышиных моделях ксенотрасплантатов глиобластомы мультиформной ортотопическая человека
Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предоставляет доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность intrabrain доставлены сотовой immunotherapies.
Abstract
Глиобластомы мультиформной (GBM), наиболее частые и агрессивной первичного мозга рак в взрослых, обычно ассоциируется с плохой прогноз, и скудные эффективной терапии были предложены за последнее десятилетие. Среди перспективных кандидатов для проектирования роман терапевтических стратегий сотовой immunotherapies были направлены для ликвидации весьма инвазивных и химио радиационно опухолевых клеток, вероятно, участвующих в быстрое и роковой рецидив этой рака. Таким образом, сменит аллогенной GBM-реактивной эффекторов иммунных клеток, таких как человека Vϒ9Vδ2 Т-лимфоцитов, вблизи опухоли будет представляет собой уникальную возможность предоставлять эффективные и высококонцентрированный терапевтических агентов непосредственно в сайт о злокачественных опухолей мозга. Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предусматривает доклинических доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность этих клеточных immunotherapies, которые полагаются на стереотаксической инъекции аллогенной лимфоцитах человека в intrabrain опухоли кровати.
Introduction
GBM (который класс IV астроцитома), является наиболее частым и агрессивной первичного мозга рак в взрослых. Несмотря на агрессивные методы лечения, которые сочетают хирургии и радио химиотерапии GBM остается связанной с очень плохим прогнозом (медиана выживаемости 14,6 месяца и 2-год смертности > 73%)1. Это свидетельствует, что были проверены несколько эффективных терапевтических достижений за последние десятилетия2. Среди кандидатов для разработки более эффективных терапевтических стратегий3,4,5immunotherapies6 в настоящее время изучаются для отслеживания и ликвидации очень инвазивных и радио/химио устойчивые опухоли клетки, предположительно для их ключевой вклад в быстрое и роковой опухоли рецидив7. Различные потенциальные иммунологические цели были выявлены и предложены для immunotherapies, связанных с естественной или модифицированных αβ или ϒδ Т-лимфоцитов как GBM-специфические антигены опухоли или стресс индуцированного молекул8,9, 10. Возможность администрировать выбранных GBM-реактивной иммунных клеток-эффекторов представляет собой уникальную возможность предоставлять повышенные количества эффекторные лимфоциты непосредственно на сайт остаточного злокачественности. Для поддержки этой стратегии, мы недавно показали, что модели, основанные на иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая первичной человека GBM ксенотрасплантатов добросовестно итог развития опухолей головного мозга в GBM больных9,11. Кроме того эти модели были использованы для демонстрации сильное противоопухолевое эффективность восприимчивую передаваемых аллогенной лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T.
Этот протокол описывает критических экспериментальные шаги для достижения Стереотаксическая immunotherapies опухолей головного мозга, например GBM, основанный на приемных передачи аллогенной Т-лимфоцитов. В статье показано: (i) усиление терапевтического аллогенной иммунной эффекторных T лимфоциты, например лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T; (ii подготовка этих эффекторных T-лимфоцитов для инъекций; (iii) процедура стереотаксической администрации в головном мозге, вблизи опухоли. Эта статья также обеспечивает понимание поведения этих клеточных эффекторов после стереотаксической инъекции.
Представленный здесь терапевтический подход основан на инъекции 20 x 106 эффекторные клетки за дозу для каждого мозга опухоль подшипник иммунодефицитных мыши. Первоначальный в vitro расширения необходимо производить большое количество иммунных клеток. Таким образом, неспецифичный клеток разложения выполняются с использованием фитогемагглютинина (ФГА-L) и облученных клеток аллогенной фидер: мононуклеаров периферической крови (получения) от здоровых доноров и EBV вирус Эпштейна Барр-трансформированных B-лимфобластоидных клеток линии (BLCLs), полученные от получения в vitro заражение EBV-содержащих культуры супернатанта от линии клеток игрунка B95-8, в присутствии 1 мкг/мл циклоспорина A.
GBM-реактивной эффекторные клетки иммунной системы сопоставляются и отобраны в vitro анализов9. Эти эффекторные клетки активируются и усиливаются с помощью стандартных протоколов, согласно их характера (например, человеческие Vγ9Vδ2 T лимфоциты9 или человека анти вирус αβ T лимфоциты12) с минимальной чистотой > 80%, как обычно проверены гранулярных анализа. Процедура расширения клеток, подробно ниже относится к различных лимфоцитов человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приемных передача выбранных родной или инженерных иммунной эффекторных клеток представляет собой перспективный подход для эффективного лечения опухолей, таких как инфильтративный мозга рак, заботясь о ограничения определено против-трансформированных клеток15, <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят сотрудников больницы университета животных фонда (ют) Нант для животноводства и ухода, клеточной и тканевой визуализации объекта ядра Нант университета (MicroPICell) для обработки изображений, и цитометрии фонда (Cytocell) от Нанта для их экспертной технической помощи. Эта работа финансировалась INSERM, CNRS, Université de Nantes, институт, Национальный du рака (Инка #PLBio2014-155), Национальная лига против le рака (AO межрегиональных 2017) и Европейский консорциум Transcan2 ERA-Net (Immunoglio). Команда финансируется фонд pour la Recherche Пущинский (DEQ20170839118). Эта работа осуществлялась в контексте LabEX МПО и IHU-Сести программ, поддержке национальных исследований агентства Investissements будущее через программы НРУ-11-LABX-0016-01 и АНР-10-IBHU-005, соответственно. IHU-Сести проект поддерживается также Нант Metropole и региона Луары. Авторы благодарят Рафия Chirine за помощь в исправлении рукопись.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet?. Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
