Stereotactic adoptivforeldre overføring av cytotoksiske immunceller i Murine modeller av Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts
Summary
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse og stereotaxic administrasjonen av allogene menneskelige lymfocytter i immunodeficient mus bærer orthotopic primære hjernesvulster. Denne studien gir en proof-of-concept for både gjennomførbarhet og antitumor effekten av intrabrain-levert mobilnettet immunotherapies.
Abstract
Glioblastom multiforme (GBM), den mest hyppig og aggressiv primære hjernen kreften i voksne, er vanligvis forbundet med en dårlig prognose knappe effektiv terapi foreslått det siste tiåret. Blant lovende kandidatene for utforming av romanen strategier, mobilnettet immunotherapies har blitt målrettet for å eliminere svært invasiv og kjemoterapi-radioresistant kreftceller, sannsynlig involvert i en rask og dødelig tilbakefall av denne kreften. Dermed administration(s) av allogene GBM-reaktive immun celle effektor, som menneskelige Vϒ9Vδ2 T-lymfocytter, i nærheten av svulsten ville representerer en unik mulighet til å levere effektiv og svært konsentrert terapeutiske agenter direkte inn i området av hjernen malignancies. Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse og stereotaxic administrasjonen av allogene menneskelige lymfocytter i immunodeficient mus bærer orthotopic primære hjernesvulster. Denne studien gir en prekliniske proof-of-concept for både gjennomførbarhet og antitumor effekten av disse mobilnettet immunotherapies som bruker stereotactic injeksjoner av allogene menneskelige lymfocytter i intrabrain svulst senger.
Introduction
GBM (som klasse IV astrocytom), er den mest hyppig og aggressiv primære hjernen kreften hos voksne. Til tross for aggressive behandlinger som kombinerer kirurgi og radio-kjemoterapi, fortsatt GBM knyttet til en ekstremt dårlig prognose (median overlevelse 14,6 måneder og en 2-år-dødelighet > 73%)1. Dette bevis at noen effektiv terapeutiske fremskritt har validert over de siste tiår2. Blant kandidater for design av mer effektive strategier3,4,5, er immunotherapies6 nå undersøkt for å eliminere svært invasiv og radio/chemo-resistant svulst celler, mistenkt for deres viktige bidrag til rask og dødelig svulst tilbakefall7. Ulike potensielle immunologiske mål var identifisert og foreslåtte for immunotherapies, som involverer naturlig eller modifisert αβ eller ϒδ T-lymfocytter som GBM-spesifikke svulst antigener eller stress-indusert molekyler8,9, 10. Muligheten til å administrere valgte GBM-reaktive immun celle effektor representerer en unik mulighet til å levere forhøyede mengder effektor lymfocyttene direkte i stedet for gjenværende kreft. For å støtte denne strategien, har vi nylig vist at modeller basert på immunodeficient mus bærer orthotopic primære menneskelig GBM xenografts trofast recapitulate utviklingen av hjernesvulster i GBM pasienter9,11. Videre ble disse modellene brukt til å demonstrere sterke antitumor effektiviteten av adoptively overførte allogene menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter.
Denne protokollen beskriver kritiske eksperimentelle trinnene for å oppnå stereotactic immunotherapies av hjernen tumorer, for eksempel GBM, basert på adopsjon overføring av allogene T-lymfocytter. Artikkelen viser: (i) forsterkning av terapeutiske allogene immun effektor T-lymfocytter, som menneskelige Vϒ9Vδ2T lymfocytter; (ii) utarbeidelse av disse effektor T-lymfocytter for injeksjon; (iii) prosedyre for stereotactic administrasjon i hjernen, i nærheten av svulsten. Denne artikkelen gir også innsikt i virkemåten til disse cellulære effektor etter stereotactic injeksjon.
Den terapeutiske tilnærmingen presenteres her er basert på injeksjon av 20 x 106 Effektor celler per dose for hver hjerne svulst-bærende immunodeficient musen. En første i vitro ekspansjon trinn kreves produserer store mengder av immunceller. Derfor ikke-spesifikk celle utvidelser utføres ved hjelp av phytohemagglutinin (PHA-L) og bestrålt allogene mater celler: perifere blod mononukleære celler (PBMCs) fra friske blodgivere og Epstein Barr Virus EBV-forvandlet B-lymphoblastoid celle linjer (BLCLs), avledet fra PBMCs av i vitro infeksjon med EBV inneholder kultur supernatant fra Marmoset B95-8 cellen linje, i nærvær av 1 µg/mL Ciklosporin-A.
GBM-reaktive effektor immunceller er forhold og valgt i vitro analyser9. Disse Effektor celler er aktivert og forsterket ved hjelp av standardprotokoller, ifølge sin natur (f.eks, menneskelige Vγ9Vδ2 T-lymfocytter9 eller menneskelig anti-herpes viruset αβ T-lymfocytter12) med minimum renhet av > 80%, som rutinemessig sjekket av cytometric analyse. Cellen ekspansjon prosedyren nedenfor gjelder ulike menneskelige lymfocytt delsett.
Protocol
Representative Results
Discussion
En adopsjon overføring av valgt innfødt eller utviklet immun Effektor celler representerer en lovende tilnærming til å effektivt behandle svulster, infiltrasjon hjernen kreft, ta vare på begrense reactivities mot ikke-transformert celler15, 16,17,18. Det sentrale nervesystemet, som omfatter hjernen, har imidlertid en bestemt immun rang, spesielt på grunn av eksistensen av blod – hjerne b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker hos University Hospital dyr anlegg (UTE) av Nantes for husdyrhold og pleie, mobil og tissular imaging kjernen anlegg av Nantes University (MicroPICell) for bildebehandling og funksjonen cytometri (Cytocell) fra Nantes for deres ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut nasjonale du kreft (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le kreft (AO interregionalt 2017) og europeiske konsortiet ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). Teamet er finansiert av Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med LabEX IGO og IHU-Cesti programmene, støttet av den nasjonale forskning byrået Investissements d’Avenir via programmene ANR-11-LABX-0016-01 og ANR-10-IBHU-005, henholdsvis. IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Metropole og regionen Pays de la Loire. Forfatterne takker Chirine Rafia for å gi hjelp til å korrigere manuskriptet.
Materials
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma–are we there yet?. Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O’Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
