3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷
Summary
ここでは、設計し、高スループット ゼブラフィッシュ胚配列 96 ウェル プレートにそのようなテンプレートの利用に関する詳細な手順が続くテンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚を作製するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ゼブラフィッシュ、よく発達生物学、環境毒物学および人間の病気で使用される国際的に認められた淡水生物関連研究分野。大規模な産卵、胚の透明度、迅速かつ同時開発など、独自の機能によりゼブラフィッシュ胚大規模な化学物質の毒性評価にしばしば使用と薬物スクリーニング。大人のゼブラフィッシュの産卵、胚の選択、およびウェル プレートに胚を配列複写する、典型的なスクリーニング プロシージャが含まれます。そこから、胚は、露出と、化学物質の毒性にさらされてまたは薬・化合物の有効性は表現型の観察に基づいて比較的迅速に評価できます。これらのプロセスの中で配列複写する胚はスループット レベルを制限する最も時間のかかる、労働集約的な手順の 1 つです。このプロトコルは 3 D プリントの計測テンプレートの使用と相まって真空操作この面倒な手順をスピードアップする革新的なアプローチを提案する.本プロトコルでは、計測テンプレート、実験的セットアップの詳細な手順については、代表的な結果が続くの全体のデザインについて説明します。実装された場合、このアプローチはさまざまな科目をテストとして zebrafish の胚を用いた研究アプリケーションで有利証明する必要があります。
Introduction
人気のモデル生物としてゼブラフィッシュ、薬および毒物学1,2,3,4の分野で広く使用されます。体外のプラットフォームと比較して、ゼブラフィッシュを提供多くの大きい生物の複雑さ、1 つまたは 2 種類の細胞が提供できなかった。モデル、ゼブラフィッシュの大産卵、迅速かつ同時の萌芽期の開発および高い臓器全体の生物をことのほか、透光性は大規模な毒性または薬/化合物5をスクリーニングするためにこのモデルのユニークな利点を与えています。毎週 1 組大人のゼブラフィッシュのによって生成される胚の数は他の全体の動物モデルを上回るし、高スループット スクリーニングに適したになっています。
ゼブラフィッシュを用いた典型的なスクリーニング プロシージャには、大量アダルト ゼブラフィッシュ産卵、胚の選択と適切な容器の水浸漬による暴露を受ける場所に胚を配列複写するなどの手動作業にはが含まれます。胚の開発は監視され、死亡率、孵化率、異常など観測可能なエンドポイントがしばしば手動で評価され、化学物質の毒性の徴候の効果の予備的な id として使用薬や化合物。以前審査手続きをスピードアップするための自動化された画像とコンピューター支援画像解析などのアプローチの検討しています。たとえば、顕微鏡画像処理機能の高いコンテンツでは 96/384 ウェル プレート6からの様々 な発達段階でゼブラフィッシュ胚に対して自動明視野または蛍光イメージングを実行する適応されています。顕微鏡と相まってマイクロ流体デバイスは、ゼブラフィッシュ脳神経7のイメージングのための現在の操作を通じて幼虫を配置する使用されました。これらのアプローチは、伝統的な手作業と比較してイメージの獲得の効率を大きく改善できます。また、生成される画像の数が多い、画像解析ツールも開発されているデータ処理速度を上げる劉らと Tuらによって示されるように8,9。
画像処理と画像解析のスループット レベルが増加すると、検診率制限ステップは 96 または 384 ウェル プレートにそれらを配列複写を意味する通常の暴露のゼブラフィッシュ胚の準備過程であることが明らかになった。このボトルネックのステップを解決するためにビジョンを統合したロボットは、チャートらによって開発されました。十我々 ではなく洗練された11手動処理ですが楽器を交換する以前、このようなテクニックを実装するための深い学習曲線があります。そのため、簡単に使用できるアプローチ ゼブラフィッシュ スクリーニングのスループット レベルをさらに向上させる一つの重要な要因になるし、この作品の主な目的は、提供します。
この作業には、設計し、3 D 印刷テンプレートを配列複写する胚を作製しました。そのような計測テンプレートは、標準の 96 ウェル プレートに適合の井戸にゼブラフィッシュ胚をわなに掛けるに設計されました。胚を選択して個々 も一つずつにそれらを配列複写するのではなく、1 つが胚および配列すべて 96 胚多層板に一度に行います。このテンプレートは、次のプロトコルを使用して、1 つは大幅語のブーストのスクリーニング能力は少なくとも 10 倍、手動操作と比較して、多層板に胚を配列複写の効率を向上できます。下記プロトコルには、テンプレート、ゼブラフィッシュの産卵、採卵を配列複写と配列複写のための全体的なデザインが含まれています。図 1計測テンプレートの全体的なデザインを示しています。図 2は、部品 3 と 4 で説明されているテンプレートを使用してステップバイ ステップのプロトコルの概要を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュ胚を配列複写する 3 D 印刷テンプレートの実装を成功させるために細心の注意を必要とするこのプロトコルの 2 つの重要なステップがあります。
計測テンプレートのデザインの最も重要な要因は、わなに掛ける事も。各ウェルに閉じ込められて 1 つだけ胚があることを確認して、1 つは直径およびわなに掛ける事の井戸の深さ、スルーホールの直径に細?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は「青春 1000plan」プログラム、同済大学と NSFC グラント # 21607115 からスタートアップ資金、21777116 (Lin) によって支えられました。
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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