En 3-dimensionell (3D)-tryckt mall för hög genomströmning zebrafiskar Embryo Arraying
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att designa och tillverka ett zebrafiskar embryo arraying mall, följt av en detaljerad procedur på användningen av sådan mall för hög genomströmning zebrafiskar embryo arraying in en plattan med 96 brunnar.
Abstract
Zebrafiskar är en globalt erkänd färskvatten organismen används ofta i utvecklingsbiologi, miljötoxikologi och mänskliga sjukdomar relaterade forskningsområden. Tack vare sina unika egenskaper, inklusive stora fruktsamhet, embryo translucens, snabb och samtidig utveckling, etc., zebrafiskar embryon används ofta för stor skala toxicitet bedömning av kemikalier och läkemedel/förening screening. En typisk screeningförfarande innebär vuxen zebrafiskar lekande, embryon urval och arraying embryon till plattor med flera. Därifrån, embryon utsätts för exponering och kemiska toxicitet eller effektiviteten av de droger/föreningarna kan utvärderas relativt snabbt utifrån fenotypiska observationer. Bland dessa processer är embryon arraying en av de mest tidskrävande och arbetsintensiva steg som begränsar dataflödesnivån. I detta protokoll presenterar vi en nyskapande strategi som gör användningen av en 3D-tryckt arraying mall tillsammans med vakuum manipulation för att påskynda detta mödosamma steg. Protokollet häri beskriver den övergripande utformningen av mallen arraying, detaljerade experiment och stegvisa anvisningar, följt av representativa resultat. När genomförs, bör detta tillvägagångssätt bevisa fördelaktigt i en mängd forskningstillämpningar med zebrafiskar embryon som testning ämnen.
Introduction
Som en populär modellorganism, är zebrafisk allmänt används i fälten för läkemedel och toxikologi1,2,3,4. Jämfört med in vitro- plattformar, zebrafiskar erbjuder mycket större biologiska komplexitet som en eller två celltyper kunde inte erbjuda. Förutom att vara en hel organism modell, zebrafiskars stora fruktsamhet, snabb och samtidiga embryonal utveckling och hög orgel translucens har gett denna modell unika fördelar som ska användas för storskaliga toxicitet eller droger/förening screening5. Hundratals embryon produceras av ett par vuxna zebrafiskar varje vecka överträffa alla andra hela djurmodeller och har gjort det lämpar sig för hög genomströmning screening.
En typisk screeningförfarande med zebrafiskar innebär en betydande mängd manuellt arbete, såsom vuxna zebrafiskar lekande, embryo urval, och arraying embryon i lämpliga behållare där de utsätts för exponering genom nedsänkning i vatten. Utvecklingen av embryon övervakas och observerbara slutpunkter som dödlighet, kläckbarhet och abnormitet ofta utvärderas manuellt och används som identifiering av preliminära toxicitet av kemikalier eller upplysningar av effektivitet droger eller föreningar. För att påskynda screeningen, har lösningar som automatiserad avbildning och datorstödd bildanalys undersökts tidigare. Till exempel, har Mikroskop med hög halt imaging funktioner anpassats till utföra automatiserade ljusa fält eller fluorescens imaging på zebrafiskar embryon i olika utvecklingsstadier från plattor med 96/3846. Mikroflödessystem enheter tillsammans med Mikroskop användes att placera zebrafiskar larver genom nuvarande manipulation för avbildning av hjärnan nervceller7. Dessa metoder kan avsevärt förbättra effektiviteten i bild förvärv jämfört med traditionell manuell drift. Dessutom med stort antal bilder som genereras, har bild analysverktyg också utvecklats för att påskynda databehandlingen, vilket framgår av Liu et al. och Tu o.a. 8 , 9.
Som dataflödesnivån bildbehandling och bildanalys ökar, blev det klart att det hastighetsbegränsande steget för screening ligger håller på att förbereda zebrafiskar embryon för exponering, vilket vanligtvis betyder att arraying dem i 96 – eller 384-bra plattor. För att lösa denna flaskhals steg, vision-guidad robotics har utvecklats av Mandrell o.a. 10 och oss11 tidigare att ersätta manuell hantering men instrumenten var ganska sofistikerad och det finns en djup inlärningskurva att genomföra sådana tekniker. Därför att ge en lätt-till-använda tillvägagångssätt blir en viktig faktor att ytterligare förbättra dataflödesnivån zebrafiskar screening och är huvudsyftet med detta arbete.
I detta arbete, vi utformade och tillverkade ett embryo arraying mall av 3D-utskrifter. En sådan arraying mallen är utformad att snärja zebrafiskar embryo i brunnar som passar med en standard plattan med 96 brunnar. Istället för att välja embryon och arraying dem i enskilda brunn en efter en, kunde en utföra array och embryo klämskador alla 96 embryon i en storsäck av plattan på en gång. Använda den här mallen och följande protokoll, kunde en avsevärt öka effektiviteten av arraying embryon i storsäck av plattor, som skulle i termen boost screening kapacitet minst tiofalt, jämfört med manuell drift. Protokollet beskrivs nedan innehåller en övergripande design för arraying mall, zebrafiskar lekande, embryosamlingsgrupper och arraying. Figur 1 visar den övergripande utformningen av mallen arraying. Figur 2 visar en översikt av stegvisa protokollet på med hjälp av mallen som beskrivs i delarna 3 och 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två kritiska steg i detta protokoll som kräver stor uppmärksamhet för ett framgångsrikt genomförande av 3D-tryckt mall för arraying zebrafiskar embryon.
Den viktigaste faktorn om utformningen av mallen arraying är entrapment väl. Till gör att det finns bara ett embryo instängd i varje brunn, en bör ägna stor uppmärksamhet åt diametern och djupet av entrapment brunnen, och diametern på den genomgående hål. Rekommenderade diametern är inom 1,5 till 2 gånger av en ty…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av programmet ”1000plan ungdom”, start medlen från Tongji University och NSFC Grant # 21607115 och 21777116 (Lin).
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
