Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.
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Artículo de método
Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación
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Resumen
Resumen
Las ingenuo (N-hPSC) células madre pluripotentes humanas con la funcionalidad mejorada puede tener un gran impacto en medicina regenerativa. El objetivo de este protocolo es volver eficaz pluripotent humana convencional, preparado por el linaje de células (hPSC) mantenidas en condiciones libre de alimentador o feeder-dependiente a una pluripotencia ingenua-como con la funcionalidad mejorada. Este método de reversión química ingenuo emplea el factor inhibidor de leucemia clásica (LIF), GSK3β y MEK/ERK inhibición cóctel (LIF-2i), complementado con un inhibidor de tankirasa XAV939 (LIF-3i). LIF-3i vuelve hPSC convencional a un estado pluripotente estable adoptando transcripcional, bioquímicos y características epigenéticas del epiblasto antes de la implantación humana. Este método de LIF-3i requiere manipulación de la cultura de célula mínima y es altamente reproducible en un amplio repertorio de células madre embrionarias humanas (hESC) y líneas de células madre (hiPSC) libre de transgén de humanas pluripotentes inducidas. El método LIF-3i no requiere un paso re cebado antes de la diferenciación; N-hPSC pueden diferenciarse directamente con eficacias extremadamente altas y mantener karyotypic y epigenómica estabilidades (incluso de loci impresos). Para aumentar la universalidad del método, en el cóctel de LIF-3i complementado con dos pequeñas moléculas adicionales que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y erizo sónico (sHH) (purmorphamine) señalización (LIF-5i) se cultivan primero hPSC convencional. Esta breve etapa de adaptación de LIF-5i significativamente mejora la inicial expansión clonal de hPSC convencional y permite que posteriormente volvieron a ingenuos con LIF-3i solo en grandes cantidades, así evitando la necesidad de picking/subcloning raro N-hPSC colonias más adelante. HPSCs LIF-5i-estabilizado se mantienen posteriormente en LIF-3i solos sin necesidad de moléculas anti-apoptóticas. Lo más importante, reversión de LIF-3i mejora notablemente la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de hPSC convencional disminuyendo su expresión de gen de cebada de linaje y borrando la variabilidad interlineal de diferenciación dirigida comúnmente observado entre líneas hPSC independiente. Caracterizaciones representativas de LIF-3i-revertir N-hPSC son estrategias proporcionadas y experimentales para comparaciones funcionales de hPSC isogénicas en linaje cebada vs. ingenua-como Estados se contornean.
Introducción
El sistema de cultivo 2i (inhibidor de la MEK/ERK y GSK3β) fue desarrollado originalmente para refinar las culturas de las células madre embrionarias (mESC) heterogéneos basados en suero del ratón a un estado uniforme de pluripotencialidad similar al epiblasto preimplantacional de ratón1. Sin embargo, 2i no es compatible con el mantenimiento estable de humanas pluripotentes células madre (hPSC) líneas2. Los distintos compleja molécula pequeña, suplementada con factor de crecimiento y enfoques transgénicos se han divulgado recientemente para capturar supuestamente similar ingenua-como pluripotent humana m....
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Protocolo
Animales todos los procedimientos se realizaron con las pautas de cuidado de los animales y protocolos de actuación aprobados por el Johns Hopkins la escuela de medicina Instituto de cuidado de los animales y el Comité uso (IACUC).
1. preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) dependiente de la alimentación convencional (medio de hESC, MEF) o revertido ingenuo (medio de LIF-3i, MEF) hPSC cultura
-
Comprar o preparar en suministros de paso bajo de alimentadores MEF de CF1 o CF1 x embriones de ratón E13.5 DR4 híbridos siguiendo protocolos publicados4.
- Criopreservar las c....
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Resultados
Este protocolo optimiza la reversión de ingenua-como eficiente con LIF-3i en ambas culturas dependiente de alimentación y alimentador independiente linaje preparado hPSC convencional (figura 1). El protocolo detallado, aquí descrito, contornos adaptación secuencial a LIF-3i a partir de cualquier condiciones hPSC dependiente del alimentador o libre de alimentador convencional (p. ej. E8 medio).
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Discusión
El sistema de LIF-3i aplica una versión modificada del clásico 2i murino ingenuo reversión cóctel1 a células madre pluripotentes humanas. La auto renovación de hPSC (que no se puede expandir en 2i solo) se estabiliza en LIF-2i por complementar este cocktail con el inhibidor de tankirasa XAV939. LIF-3i cultura permite a granel y eficiente reversión de la hPSC convencional a un estado pluripotente que se asemeja el epiblasto preimplantacional humana3<.......
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Divulgaciones
Bajo un acuerdo de licencia entre Life Technologies y la Universidad Johns Hopkins (JHU), Dr. Zambidis tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad para la concesión de licencias de las células madre. Los términos de este arreglo son gestionados por JHU conforme a sus políticas de conflicto de intereses. Esto no altera la adhesión de los autores a las políticas de diario en el intercambio de datos y materiales.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por becas del NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein innovación, el fondo de investigación de la célula de vástago Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk ciencia Foro premio y la Fundación de Moseley.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 1 |
Referencias
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
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Reimpresiones y permisos
