Her presenterer vi en protokoll for bruk O-formet fartøy, spesialisert for suspensjon kulturer av mobilnettet aggregat, med orbital risting. De HEK293 cellene vokst i denne vesken danner mer homogen aggregater enn de dyrket i tradisjonell kultur fartøy.
Suspensjon kulturer av pattedyr celle aggregater kreves for forskjellige programmer i medisinsk og bioteknologisk. Disponibel bag-baserte metoden er en av de enkleste teknikkene for masseproduksjon av mobilnettet aggregater, men det beskytter ikke kulturer mot over aggregering, som oppstår når de samle midten nederst på kultur fartøyet. For å løse dette problemet, utviklet vi en O-formet rett og en O-formet bag, verken som inneholder en sentral-regionen. Aggregater dyrket i enten O-formet kultur fartøyet var merkbart mer ensartet i størrelse enn aggregater dyrket i konvensjonelle fartøy. Histologiske analysene viste som samler i tradisjonell kultur retter inneholdt nekrotisk kjerner mest sannsynlig forårsaket av en dårlig oksygentilførsel. Derimot vise sammendrag som ble dyrket i O-formet posen, selv de med lignende diameter til aggregat i tradisjonell kultur retter, ikke nekrotisk kjerner. Disse resultatene tyder på at O-formet vesken gir tilstrekkelig oksygen til aggregat på grunn av oksygen permeabiliteten av posen materialet. Vi foreslår derfor at denne romanen gass permeabel O-formet kultur vesken er egnet for masseproduksjon av uniform aggregater som kreves i ulike bioteknologisk.
Suspensjon cellekultur spiller en viktig rolle i celleproduksjon for regenerativ medisin1 og rekombinant protein produksjon2 fordi det er lett å skalere opp og oppnå høyt tettheter, noen ganger opptil mer enn 107 celler / mL5. Kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler3 menneskelige embryonale nyre celler 293 (HEK293)4 har blitt dyrket i suspensjon kultur og menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs) har nylig blitt dyrket i kultur bæresystem for regenerativ terapi1,6,7. Bruk av suspensjon kulturer forventes å øke i fremtiden.
I suspensjon kultur, noen linjer kan ikke vokse som enkeltceller og må derfor danner aggregat. For eksempel ikke kan hPSCs overleve i suspensjon forhold uten danner aggregat. Men presenterer dette kravet for samlet vekst vanskeligheter for uniform suspensjon kulturer. Det er dannelsen av uniform aggregater i den tidlige perioden av kultur, som avgjør effektiviteten av suspensjon kultur8. En annen vanskelighet er masse overføring av næringsstoffer i aggregat. Spesielt oksygentilførsel begrenser den maksimale størrelsen av aggregater, og en dårlig oksygentilførsel fører nekrose i midten av aggregater9. Følgelig er suspensjon kulturer av cellen aggregater vanskeligere å få enn konvensjonelle suspensjon kulturer. Likevel suspensjon kulturer er avgjørende for biomedisinsk og bioteknologi programmer.
Orbital risting fartøy er en av de enkleste kultur bæresystem som oppnå kultur medium blandinger uten impeller agitasjon. Skjæring stress fra pumpehjulet og dynamisk middels flyten er det store problemet med suspensjon kultur fordi det forårsaker celleskader og differensiering. For å oppnå omrøring med en lavere skjæring stress, har forskere og industri utviklet en rekke orbital risting fartøyet systemer2,10.
Men er konvensjonelle kultur fartøy ikke utformet for orbital risting kulturer. I orbital risting fartøy, bevege celler mot center-bunnen av fartøyene etter en middels flyt kjent som “Einsteins te blad paradox”11, som fører til ikke-homogen aggregering av celler. Sirkelflyt, forårsaket av en sentrifugalkraften og en friksjon mellom kultur medium og et fartøy, feier celler i center11,12. Konvensjonelle kultur poser for masse kultur er i tillegg firkant-formet, som er ikke egnet for orbital risting.
I denne studien utviklet vi en ny kultur bag egnet for orbital risting kulturer. Nyheten av denne vesken er O-formen som ikke har en midten regionen, så celler hindres samling på bunnen midten regionen. Vi har også vist håndtering av disse fartøyene med en HEK293 kultur å demonstrere muligheten for disse posene for bioteknologisk programmer.
I denne studien vi utviklet O-formet fartøy og utført en HEK293 suspensjon kultur i dem for en ensartet aggregater dannelse og ekspansjon. Konvensjonelle kultur fatet produsert en orbital risting kultur to forskjellige diametere av aggregater, mens vi observerte uniform mengdefunksjoner i O-formet fartøyene (figur 1). Ifølge observasjon av fordelingen av fargede perler i orbital risting forhold samle perler center-nederst en tradisjonell kultur parabol. At samlingen antagelig forårsaket forskjellen i cellen tetthet fører til ulike størrelser av aggregater. Alternativt ble perler distribuert i O-formet parabolen som ikke har regionen center bunn (supplerende figur 1). Denne fordelingen fører trolig jevnt størrelse aggregater i O-formet fartøy. En annen-brukte-tilnærming til å produsere uniform aggregater er dyrking i microwells, men dette har noen problemer, som leverer en kultur medium uten aggregater slippe ut av de microwells13. I tilfelle av O-formet fartøy, kan uniform aggregater produseres i en enkel suspensjon kultur.
Orbital risting kultur er en populærkultur benyttes for pattedyrceller. Det finnes ulike kultur metoder for masseproduksjon av pattedyrceller, som de rørt tank bioreactor14, bølge-vinket poser15, og roterende flasker. Orbital risting kulturer inneholder ikke en indre impeller for røring medium, i motsetning til rørt tanken bioreactor gjør. Denne funksjonen ligner bølge-vinket vesker og roterende flasker. Systemene pumpehjulet-fri kultur kan unngå cellular skade fra skjær styrke rundt i ulyd og realisere lav skjæring stress i suspensjon kultur. Orbital risting kultur systemer er spesielt effektivt for masseproduksjon av sensitive celler som pattedyrceller på grunn av deres høy skalerbarhet og lav skjæring stress.
O-formet fartøy kan forbedre gjenværende problemet med orbital risting kultur i dannelsen av aggregater. I orbital risting kultur systemer, overføre flytende celler i midten og bunnen av fartøyet, som er kjent som “Einsteins te blad paradox”11. Dette migrasjon fører ikke-homogen aggregering og ikke-uniform samlede produksjon i konvensjonelle orbital risting fartøy. I denne studien forhindret O-formet fartøy konsentrasjonen av celler i center-bunnen av fartøyene, hvilke er spekulere som grunnen til uniform samling i orbital risting O-formet fartøy.
Histologiske analysene viste at mengdefunksjoner i konvensjonelle parabolen inneholdt denucleated celler (figur 2a). Derimot vises denucleated celler ikke i aggregater fra O-formet fartøy (figur 2b og 2 c). Det er mulig at disse denucleated cellene ble forårsaket av en mangel på underlag som glukose, glutamin og oksygen9. Ifølge størrelse måling hadde mengdefunksjoner i O-formet fartøyene homogen diameter lavere enn 400 µm. Derimot en konvensjonell parabol, noen aggregater hadde en diameter større enn 400 µm, og disse aggregater inkludert denucleated celler. Dette resultatet antyder at opprette homogene størrelse aggregater i O-formet fartøy er effektiv i å kontrollere kvaliteten av aggregater. I tillegg er det også spekulert at oksygenering gjennom gass permeabel polyetylen filmen hindret utseendet på denucleated celler i O-formet posen.
Disse viste at disse O-formet fartøy som et enkelt system for å produsere uniform aggregat. Selv om andre kultur vesker for suspensjon kultur har vært utviklet15, er de kultur posene firkant-formet, som hindrer at kulturen effektivt blandes i orbital risting. Vesken i denne studien har en roman runde figuren egnet for orbital riste å produsere aggregat med en homogen størrelse. Denne karakteristiske av fartøy er viktig for å kontrollere forholdene og den høye reproduserbarhet celleområde i masseproduksjon. Mulig bruk av O-formet fartøyet er utbredt. Den kan brukes når produsere rekombinante proteiner fra celler og regenerativ medisin når behandling med stamceller.
I konklusjonen, utviklet vi en roman O-formet bag som er egnet for produksjon av uniform celle aggregat med en orbital risting kultur. Posen viser mulighetene for ulike biomedisinsk applikasjoner som i regenerativ medisin.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen er støttet av et samarbeid med FUKOKU, co, Ltd Takao Johnsen fra FUKOKU, co, Ltd ga ideen om O-formet kultur posen. Takamasa Sato fra FUKOKU, co, Ltd støtter denne forskningen i en beregningsformelen simulering utvikler O-formet kultur posen. Vi ønsker å verdsette tilsvarende forfatterens gjeldende tilhørighet, Osaka University, for å arbeide med publikasjonen.
HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
Automated cell counter | BioRad | TC20 |