本方案采用光标记方法，在新生小鼠中特异性识别从结肠迁移至肠外部位的免疫细胞。该策略将有助于研究生命早期宿主与微生物组之间的相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
肠道菌群在生命早期即建立，并影响免疫细胞的发育与功能。新生儿微生物群易受到多种外界因素的影响，包括抗生素使用和饮食，这些因素会影响个体对自身免疫性疾病和炎症性疾病的易感性。诸如炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）等疾病的特点是大量免疫细胞浸润至肠道。然而，受微生物群调控的免疫细胞还可能从肠道向外迁移，进而影响肠外部位的免疫应答。因此，有必要识别并表征那些可能将微生物信号从肠道传递至远端部位的细胞。本文描述了一种在新生小鼠结肠中标记细胞的方法 体内 可在迁移后于肠外位点对其进行鉴定。
引言
哺乳动物的胃肠道中栖息着数百种细菌，这些细菌与宿主之间存在着共生关系1。存在于局部微环境中的免疫细胞可促进宿主与这些微生物之间的和平共存，并建立抵御病原体入侵的保护屏障。因此，免疫细胞与微生物群之间的双向相互作用对于建立共生菌群至关重要，这类菌群能够训练宿主免疫系统，并设定免疫系统对病原体反应的阈值。微生物组成的变化，即菌群失调，可能破坏免疫稳态，干扰抑制肠道炎症的调控回路，从而导致1型糖尿病和炎症性肠病（IBD）等免疫介导的疾病2,3。
出生后的时期是一个独特的发育窗口期，在此期间，肠道微生物群落开始建立，同时免疫系统也在逐渐成熟4。出生后的微生物群并不稳定，其群落组成会自然且频繁地发生变化5。与微生物群相互作用的免疫细胞存在于肠道的两个不同解剖位置——固有层和肠上皮6。肠道中存在多种类型的免疫细胞，包括淋巴细胞（如T细胞、B细胞和先天性淋巴样细胞）以及髓系细胞（包括树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞）。这些细胞也被称为造血细胞，具有多种功能，可维持肠道屏障并保持稳态。
除了在肠道部位发挥调节功能外，....
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方案
所有动物实验均经麻省总医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其规定执行。
警告：本实验方案涉及使用3b类激光器（LG3）。操作该激光器时必须始终佩戴LG3激光防护眼镜。必须遵循相应的培训和安全准则，以避免受伤风险。
1. 激光器的设计与组装
- 将发光二极管（LED）（405 nm，19.3 mW，1400 mA，光纤耦合）连接至LED驱动器 通过 连接LED附带的4针M8连接器电缆。小心拧紧螺丝以固定连接。
- 在将光遗传学补丁电缆连接到LED之前，将LED的连接器开口朝向光源，检查是否有可见的阻塞物。如有必要，向开口吹气以清除任何阻塞物，然后将光遗传学补丁电缆插入开口中。
- 将光纤套管插入连接套管的任一端，将其与光遗传学连接线相连。将连接套管的另一端连接至连接线。 施加足够的压力以确保连接牢固，但需小心避免弯曲或折断导管中的光纤。
注意：激光未使用时，应使用保护帽覆盖脆弱的光纤套管。 - 将LED驱动器设置为连续波（CW）模式，连续调节旋钮调至0，电流限制设为1.2 A。
2. 结肠细胞的光转化
注意：在出生后1至2天，将雄性和雌性小鼠暴露于结肠内405 nm光照下，并....
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结果
使用光纤电缆将405 nm的光传递至2日龄PhAMexcised小鼠的结肠中。在先前的实验中，确定30秒的照射时间可在最小细胞毒性的情况下实现结肠细胞最大程度的光转化（图1A）。因此，按照本方案所述，对结肠的不同节段依次进行30秒的照射。激光照射后，立即处死小鼠，并检测细胞的光转化情况。将全部结肠组织制备为单细胞悬液，用荧光标记的抗CD45抗体染色，并通过流式细胞术分析检测光转化效果。未转化的Dendra2-绿色（Dendra-g）蛋白的激发和发射波长最大值分别为490 nm和553 nm，可在FITC通道中检测；而光转化后的Dendra2-红色（Dendra-r）蛋白的激发和发射波长最大值分别为507 nm和573 nm，可在流式细胞仪的PE通道中检测。Dendra2一旦不可逆地转化为红色形式，便具有高度的光稳定性，适用于长期示踪应用。
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讨论
鉴定和表征与结肠微生物群相互作用并受其影响的细胞具有重要意义，有助于阐明黏膜微环境中的信息如何传递至机体其他部位。研究肠道相关细胞迁移的一种方法是分离肠道相关细胞，随后将其过继转移至受体小鼠，以确定这些细胞的组织趋向性分布模式及其功能。12,13这种方法存在局限性，因为仅能追踪被转移的特定细胞类型。此外，从组织中分离细胞及纯化过程可能产生的假象会阻碍 体内 迁移过程。最近，有研究报道了一种利用Kaede小鼠通过内窥镜光转换技术标记肠细胞的方案14该研究发现，在成年小鼠中存在白细胞向肠道及自肠道的广泛迁移。
本报告描述了一种标记新生小鼠结肠细胞并追踪其迁移至肠外部位（如脾脏）的方法。PhAMexcised 小鼠在全身广泛表达一种可光转换的绿色荧光蛋白 Dendra2，该蛋白在紫外光照射下可被不可逆地转化为红色荧光。对新生小鼠结肠施加 405 nm 光照后，可标记 CD45.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Nitya Jain 获得了美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所职业转型奖 1K22AI116661-01 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 激光 | |||
| 发光二极管（LED） | THORLABS | M405FP1 | 警告：此为3b类激光器。使用激光时必须佩戴安全护目镜。其发射波长为405 nm，电流为1400 mA。该设备为光纤耦合，接受SMA接口。https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED驱动器 | THORLABS | LEDD1B | 向激光器提供1200 mA的恒定电流。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| 光遗传学补光光纤线 | THORLABS | M87L01 | 长度为1 m、带SMA接口的光纤线。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| 光纤套管 | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 长度为5 mm的套管，外径为500 µm，内径为480 µm。数值孔径（NA）值为0.5。套管材质为氧化锆，外径1.25 mm。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| 电源 | THORLABS | KPS101 | 提供15 V电压，电流为2.4 A。https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3激光安全护目镜 | THORLABS | LG3 | 橙色镜片，可见光透过率为47%。https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| 红光 | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W灯泡。https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| 肠细胞分离 | |||
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | 警告：吸入该麻醉剂可能导致头晕、嗜睡，甚至意识丧失。应在II级生物安全柜中使用该麻醉剂。 https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1× HBSS | Gibco | 14025076 | 无钙镁。https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| 小牛血清 | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 浓度为0.5 M。https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 警告：吞食有害，可引起皮肤刺激。浓度为1 M。https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 浓度为1 M。https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| 培养皿 | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70微米细胞筛 | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| 微型磁力搅拌子 | Fisherbrand | 1451364 | 每次使用后需用70%乙醇冲洗，使用前需用蒸馏水冲洗数次。搅拌子长度为8 mm，呈八角形。https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| 磁力搅拌器 | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| 胶原酶 | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1× PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| 移液器辅助器 | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL刻度移液管 | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL刻度移液管 | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL锥形离心管 | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL锥形离心管 | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 单细胞悬液制备 | |||
| Eppendorf管 | Seal-Rite | 1615-5500 | 容量为1.5 mL。https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| 组织匀浆器 | Kimble | K7495400000 | 需使用2节AA电池。https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| 匀浆器头 | Kimble | 7495210590 | 塑料材质，0.5 mL规格的头。https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40微米细胞筛 | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| 抗体 | |||
| BV786抗小鼠CD45 | BD | 564225 | 克隆号3O-F11。https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| 活/死细胞染色试剂 | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| 其他 | |||
| 剃须刀片 | VWR | 55411-050 | 用于断头处死。https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
参考文献
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198
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