Udgravning af planternes rødder fra feltet samt behandling af prøver i endosphere, rhizosfære og jord er beskrevet i detaljer, herunder DNA-ekstraktion og data analysemetoder. Dette papir er beregnet til at aktivere andre laboratorier til at anvende disse metoder til undersøgelse af jordbundens, endosphere og rhizosfære microbiomes.
Plante og jord microbiome undersøgelser stadig vigtigere for forståelse roller mikroorganismer spiller i landbrugets produktivitet. Formålet med dette manuskript er at give detaljer om, hvordan du hurtigt prøve jord, rhizosfære og endosphere af replikerede markforsøg og analysere ændringer, der kan opstå i de mikrobielle samfund prøvetype, behandling og plante genotype. Eksperimentet bruges til at påvise disse metoder består af replikerede felt parceller indeholdende to, ren, varm-sæson græsser (Panicum virgatum og Andropogon gerardii) og en lav-mangfoldighed græs blanding (A. gerardii, Sorghastrum nutans, og Bouteloua curtipendula). Kort, planter er udgravet, en bred vifte af rødder er skåret og placeret i fosfat buffer, og derefter rystet til at indsamle rhizosfære. Rødderne er bragt til laboratoriet på is og overflade steriliseret med blegemiddel og ethanol (EtOH). Rhizosfære er filtreret og koncentreret ved centrifugering. Opgravet jord fra omkring rodklumpen er placeret i plastikposer og bragt til laboratoriet, hvor en lille mængde af jord er taget for DNA ekstraktioner. DNA er ekstraheret fra rødderne, jordbunden og rhizosfære og derefter forstærkes med primere for regionen V4 af 16S rRNA-genet. Amplikoner sekventeret, så analyseret med åben adgang bioinformatik værktøjer. Disse metoder giver forskere til at teste, hvordan den mikrobielle samfund mangfoldighed og sammensætning varierer på grund af prøvetype, behandling, og plante genotype. Bruger disse metoder sammen med statistiske modeller, viser de repræsentative resultater, er der betydelige forskelle i mikrobielle samfund af rødder, rhizosfære og jord. Metoder præsenteres her giver et komplet sæt af trin til hvordan man kan indsamle feltprøver, isolere, uddrag, kvantificere, forstærke og DNA-sekvens, og analysere mikrobielle samfund mangfoldighed og sammensætning i replikerede feltforsøg.
Microbiome forskning har stor betydning for forståelse og manipulere økosystem processer som næringsstof cykling, organisk materiale omsætning, og den udvikling eller hæmning af jord patogener1,2. Dette område af forskning også rummer et stort potentiale for at forstå virkningerne af jord mikrober på produktiviteten i naturlige plantesamfund og agroecosystems. Mens der er mange undersøgelser, der har fokuseret på jord microbiome i naturlige økosystemer, har færre fokuseret på plante rhizosfære og endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerer landbrug landskabet i store dele af den stat, at foretage undersøgelser af disse jordtyper hvor landbrugsmæssigt vigtige afgrøder dyrkes et vigtigt emne for forskningen. Formålet med denne metoder papir er at give forskerne et standard sæt af protokoller til at beskrive de mikrober til stede i agroecosystems, for at bestemme, hvordan planterødder ændre de mikrobielle samfund i rhizosfære og endosphere, og at i sidste ende forstå de funktioner, disse mikrober spille i jordens sundhed og plantesundhed produktivitet.
Metoden præsenteres her adskiller sig lidt fra metoder, der anvendes af andre4,5 i, dette dokument tager sigte på læring som mikrober er udelukkende inde i roden og hvordan de adskiller sig fra mikrober umiddelbart uden rod i den rhizosfære. Amplikon sekventering anvendes i denne undersøgelse identificerer de mikrobielle taxa fundet i DNA-prøven og giver mulighed for efterforskerne at finde ud af, hvordan Fællesskaberne ændres afhængigt af prøvetypen eller behandling. En af de vigtigste forskelle mellem denne protokol og en meget lignende protokol, der bruges af Lundberg et al. 6 er at i stedet for sonikering, denne protokol bruger overflade sterilisation med blegemiddel og ethanol til at fjerne rhizosfære fra rødderne. Andre har også brugt overflade sterilisation effektivt7,8,9,10. Disse metoder er ikke mere fordelagtig end andre metoder, men lidt anderledes. Disse metoder er særligt velegnet til store markforsøg, fordi med nok folk er det muligt at behandle over 150 felt parceller pr. dag, der tilføjer op til ca 450 prøver når opdelt i endosphere, rhizosfære og jord. Dette manuskript beskriver i detaljer de metoder, der anvendes til prøve i feltet, behandle materialet i laboratoriet, uddrag og DNA-sekvens, og giver en kort oversigt over de skridt til at analysere de resulterende sequencing data.
Metoderne beskrevet i dette manuskript bør give forskerne nemt indtaste inden for jord og plante metagenomics. Gennem årene har vi forfinet vores metoder siden gennemføre forsøget er beskrevet i dette håndskrift. En ændring er, at vi nu pre pladeselskab rør før du går ud til området for at prøve. Vores laboratorium bruger et stregkodesystem system og en etiketprinter. Labelprinter ikke kun sparer tid, når mærkning rør, men også gør alting nemmere at spore og til korrekt at identificere prøver uden luner i menneskehænder skriftligt. Et andet kritisk punkt er, at vi forsøger at behandle materialet efter bringer det tilbage fra området så hurtigt som muligt. Vi tilstræber at fryse jorden anvendes til DNA-analyse, sterilisere og fryse rødderne, og filtrere og fryse rhizosfære inden for 12 til 36 timer efter hjemkomsten fra feltet. DNA ekstraktion procedurer er lang med mange trin, især for jord og rhizosfære, så vi købte en robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher), der minimerer hænderne på tid til DNA udvinding protokoller, reducerer menneskelige fejl, der kan indføres, og forbedrer sammenhængen i den måde forskellige partier af jord, rødder eller rhizosfære behandles. Når du arbejder med plantemateriale er det vigtigt at afgøre typen root studeres eller at tage en række forskellige typer rod at få en “repræsentativ”. Opretholdelse af rødder og blade i frossen tilstand, når udførelse DNA-ekstraktion er vigtig, som at sikre, at der er ingen krydskontaminering mellem prøver ved påfyldning 96-brønd DNA udvinding plader. En anden vigtig faktor til at overveje, er antallet af gentagelser skal bruges, når designe markforsøg og bruge et komplet randomiseret design, hvor det er muligt26. På grund af høje felt variation kan det være nødvendigt at have et stort antal flergangsbestemmelser til at opdage små forskelle. Endelig fra vores oplevelse er det vigtigt at sørge for jord ikke er for vådt, når udgravning rødderne. Hvis jorder er mættet med vand, det er ikke kun rodet at arbejde med, men det er også meget vanskeligt at definere rhizosfære og fjerne jord fra rødderne.
En ændring, der var lavet tidligt under udviklingen af disse metoder var i stedet for at ryste rør i hånden for at frigive rhizosfære vi opgraderet til vortexers drevet af en gasgenerator til at gøre arbejdet lettere og mere standardiseret i tid og måde at hver tube blev ophidset. En begrænsning af amplikon sekventering tilgang er at den taksonomiske opløsning af resultaterne er ofte begrænset og mange OTUs er ukendt eller kun kendt på niveauet familie eller slægt. Dette forskningsfelt hurtigt udvikler sig, så det er vigtigt at være opmærksom på nye og udvikle metoder, især for data-analyse, der kan forbedre løsningen af resultaterne.
Disse protokoller er kun for at studere bakterier og archaea, ikke svampe. Brug af forskellige primere for forstærkning vil give mulighed for undersøgelse af svampe samfund ved hjælp af de samme DNA prøver27,28. Disse metoder kræver ikke indkøb af store mængder af udstyr, fordi metoderne, der kan forenkles. De metoder vi beskrive her er primært til bestemmelse af “hvem er der”, men feltet hurtigt udvikler sig til vigtige spørgsmål om funktion, som kan løses ved hjælp af shotgun sekventering metoder, isolation og test funktionaliteten af mikrober, eller sekventering hele mikrobielle genomer.
De repræsentative resultater fremhæve forskellene i mikrobielle samfund, der kan identificeres ved hjælp af de beskrevne metoder. Ved hjælp af en beta-mangfoldighed tilgang til data analyse22blev kompositoriske forskelle vist mellem prøve typer. Disse forskel er blevet tydeligt observeret i de fleste andre undersøgelser, hvor endosphere, rhizosfære og jord indeholder unikke mikrobielle samfund3. Shannon diversitet indeks var beregnet til at bestemme den overflod og jævnhed i den mikrobielle arter, der forekommer inden for hver planteart i endosphere, rhizosfære og jord. Som vist i denne undersøgelse og i mange andre, er alpha mangfoldighed højest i jord, mindske lidt i rhizosfære og derefter faldende betydeligt i endosphere3,5,29. Disse resultater viser, at metoderne beskrevet her er egnet til at identificere kompositoriske ændringer i endosphere, rhizosfære og jord.
Dominans af proteobakterier er et fælles resultat i undersøgelser om endosphere og jordbundens30,31,32. Endosphere har generelt et lavere mangfoldighed af mikrobielle arter med en højere relativ overflod af proteobakterier. Dette understreger igen, at resultaterne her er repræsentant for andre fund i litteraturen. Effekterne behandling i denne undersøgelse var ikke signifikant forskellig og to store grunde der kan være at de forskelle, der er pålagt af behandlingerne, der ikke var stor nok til at generere tilstrækkelig variation til at opdage og at denne prøve blev gjort i slutningen af den vækstsæson, når felterne muligvis har haft tilstrækkelig tid til at trække ned af kvælstof til lignende niveauer, hvilket er hvad blev målt i slutningen af sæsonen. I en anden undersøgelse ved hjælp af samme befrugtning rente over en længere periode, blev kun forholdsvis små ændringer i sammensætningen af microbiome målt33. Andre undersøgelser har vist ændringer i både svampe- og bakterielle samfund på grund af kvælstof gødning34,35.
Plantearter er kendt for at spille en rolle ved fastsættelsen af deres microbiomes3,32,36 , og selv små forskelle i mikrobielle samfund variation har påvist mellem forskellige plante genotyper inden for en enkelt art37. I denne undersøgelse fandt en signifikant forskel i mikrobielle samfund sammensætning mellem plantearter. I alle de prøve typer det viste sig at switchgrass havde de mest forskellige mikrobielle sammensætning, men forskellene mellem arter var kun statistisk signifikant i endosphere. Rhizosfære Fællesskabet sammensætning kan være blevet betydeligt, hvis flere replikater var tilgængelige til analyse.
Kombinerede felt, lab og analytiske protokoller er beskrevet her giver en kraftfuld metode til at studere hvordan forskellige faktorer indflydelse sammensætningen af mikrobielle samfund i jordbund, rhizosfære og endosphere af rødder36. Der er en masse arbejde at gøre i området for at studere microbiomes, navnlig landbrugs områder. Vigtige spørgsmål om hvordan udbyttet er ændret af jord microbiome har endnu at blive fuldt belyst. Selv de mest grundlæggende spørgsmål vedrørende hvordan sædskifter påvirke jorden microbiome, hvordan timing ændrer microbiome, hvordan abiotisk stress ændrer microbiome, hvordan jordtype interagerer med disse faktorer til at ændre microbiome, og om der er Universal mikrober i visse afgrøder eller regioner i USA er alle uafklarede spørgsmål. Disse metoder vil også være nyttigt for epidemiologiske undersøgelser for at identificere tilstedeværelse og persistens af patogene og gavnlige bakterier. En anden kommende horisont for disse metoder vil være at begynde at integrere de DNA-metoder, der beskrives her med plante og mikrobe RNA og metabolitten data. Yderligere forbedring og afprøvning af flere variabler vil være vigtigt for yderligere optimering af disse protokoller.
The authors have nothing to disclose.
Udviklingen af dette manuskript er støttet af National Science Foundation EPSCoR Center for rod og Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Dataindsamlingen blev støttet af midler fra University of Nebraska-Lincoln, landbrugs-forskning og udvikling og af en luge tilskud fra USDA. Vi anerkender også støtte fra USDA-ARS og støtte blev leveret fra landbrug og fødevarer forskning initiativ konkurrencedygtige tilskud nr. 2011-68005-30411 fra USDA National Institute for fødevarer og landbrug til at oprette og administrere disse felter.
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |