Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka larval zebrafiskar och fathead minnow rörelseapparaten aktiviteter och photomotor svar (PMR) med hjälp av en automatiserad mjukvara. När den integreras i gemensamma toxikologi bioassays, ger analyser av dessa beteenden ett diagnostiskt verktyg för att undersöka kemiska bioaktivitet. Detta protokoll beskrivs med koffein, en modell neurostimulant.
Fisk modeller och beteenden används alltmer inom biomedicinsk vetenskap; fisk har dock länge varit föremål för ekologiska, fysiologiska och toxikologiska studier. Med hjälp av automatiserad digital tracking plattformar, senaste ansträngningar i neurofarmakologi utnyttjar larval fisk rörelseapparaten beteenden för att identifiera potentiella terapeutiska mål för romanen små molekyler. Liknande till dessa insatser, forskning i miljövetenskap och jämförande farmakologi och toxikologi undersöker olika beteenden av fisk modeller som diagnostiska verktyg i skiktad utvärdering av föroreningar och realtidsövervakning av ytvatten för främmande hot. Zebrafiskar är en populär larval fisk modell inom biomedicinsk vetenskap, är fathead minnow en gemensam larval fisk modell i ekotoxikologi. Fathead minnow larver har tyvärr fått betydligt mindre uppmärksamhet i beteendevetenskapliga studier. Här, vi utveckla och demonstrera en beteendevetenskaplig profil-protokollet använder koffein som en modell neurostimulant. Även photomotor Svaren av fathead promelas påverkades ibland av koffein, zebrafiskar var betydligt mer känsliga för photomotor och rörelseapparaten slutpunkter, som svarat på miljömässigt relevanta nivåer. Framtida studier behövs för att förstå jämförande beteendemässiga känslighet skillnader bland fiskar med ålder och tid på dagen, och att avgöra om liknande beteendemässiga effekter skulle uppstå i naturen och vara vägledande för negativa resultat på enskilde eller befolkningsnivåer av biologisk organisation.
Även om fisk modeller används alltmer för biomedicinska studier, har fisk rutinmässigt använts för studier av ekologi och fysiologi, att undersöka kontaminering av ytvatten och förstå toxikologiska gränsvärden av kemikalier. Sådana insatser är viktiga eftersom kemiska föroreningar kan försämra akvatiska ekosystem och äventyra kvaliteten på källa vattenförsörjning1,2. De flesta av kemikalier i handel, dock saknas även grundläggande toxikologi information3.
Djurmodell analyser som traditionellt använts i föreskrivande toxicitetstester är resurskrävande och inte ger hög genomströmning, tidig tier screening behövs för toxicitet i 21st century4. Därefter finns det en växande drivkraft att anta och utnyttja in vitro- modeller som kan snabbare och mer effektivt skärmen föreningar för biologiska aktiviteter3,5. Även om cellbaserade modeller presentera många möjligheter, de saknar ofta biologisk komplexitet, och står alltså inte för många viktiga hela organismen processer, inklusive metabolism6.
Zebrafiskar är en gemensam biomedicinsk djurmodell som vinner popularitet som ett alternativ modell i vattenlevande toxikologi och ekotoxikologi7,8. Med tanke på deras ringa storlek, snabb utveckling och hög fruktsamhet, kan fisk modeller användas för att snabbt och effektivt skärmen kemikalier för bioaktiviteten och toxicitet vid den hela organism skala9. Med hjälp av automatiserad mjukvara ger larval zebrafiskar beteenden förbättrade diagnostiska verktyg i screening föroreningar för toxicitet10,11. Studier i de farmaceutiska vetenskaperna har visat att rörelseapparaten slutpunkter är informativa av kemiska verkningsmekanismer, kan användas till fenotyp beteenden och sedan identifiera preliminärt subcellulär mål för romanen molekyler12, 13. Zebrafiskar är en populär larval fisk modell inom biomedicinsk vetenskap, fathead minnow är en gemensam, ekologiskt viktiga fisk-modell som används för ekotoxikologiska studier och under blivande (t.ex. nya kemiska utvärderingar) och retrospektiv (t.ex. omgivande ytvatten eller avlopp spillvatten ansvarsfrihet övervakning) miljöbedömningar. Beteendemässiga Svaren av larval fathead promelas har tyvärr fått markant mindre uppmärksamhet än zebrafisk. Vår pågående forskning med två gemensamma larval fisk modeller, zebrafiskar och fathead minnow, antyder att larver fiskar simma mönster visas unika för förväntade lägen eller verkningsmekanismer för olika kemikalier. Således ger beteendemässiga slutpunkter potential att snabbt och känsligt undersöka kemikalier för toxicitet och att identifiera subcellulär mål för industriella kemiska och andra föroreningar, särskilt under tidig tier bedömningar.
Vi rapporterar här, ett protokoll för att pröva beteendemässiga svar profiler i larval fisk. Vi visar dessa metoder använder koffein, en modell neurostimulant och en gemensam vattenlevande förorening som introduceras till akvatiska system genom utsläpp från avloppsvatten behandlingar växter efter konsumtion av livsmedel, drycker, och läkemedel formulerat med koffein14. Vi undersöker beteendemässiga Svaren till koffein i båda larval zebrafiskar och fathead minnow, inklusive till en plötslig förändring i belysning villkorar, som ofta kallas ett photomotor svar (PMR) under farmaceutiska studier med embryonala och larver Zebrafiskar13,15. Vi har ytterligare identifiera effekterna av koffein över flera rörelseapparaten slutpunkter att utveckla kemiska svar profiler för varje fisk modell. Nivåer för behandling av koffein som används i denna studie utgör den övre centiles av exponering distributioner baserat på uppmätta miljövärden koffein16. Vi har även behandlingar referensanvändare larval fisk LC50 värdena och terapeutiska hazard värdet (THV), en farmaceutisk koncentration i vatten som förväntas resultera i plasmanivåer i fisk konsekvent med en plasma från människa terapeutisk dos.
När du väljer kemisk behandling nivåer för beteendemässiga toxikologistudier, måste flera faktorer beaktas. Behandling koffeinnivåer i den aktuella studien valdes ut baserat på övre variablen värden för förväntade miljömässiga exponeringsscenarier från avloppsvatten avloppsvatten16. När det är möjligt väljer vi rutinmässigt för vattenlevande toxikologistudier med probabilistiska exponering bedömningar av miljömässiga observationer19,20,21nivåer på behandling. En THV, som är calculable för läkemedel, ingick också som en behandling i den aktuella studien. THV värden (ekv. 1)22,23 definieras som förutspådde vatten koncentrationer leder till humana terapeutiska doser (Cmax) av läkemedel i fisk23, inspirerade från inledande plasma modellering insatser24och är beräknat på blod: vatten kemiska partitionering koefficienter (ekv 2)25.
THV = Cmax / log PBW (ekv. 1)
log PBW = log [(100,73. log Kow · 0,16) + 0.84] (ekv 2)
Här väljer vi också subletala behandling nivåer i förhållande till zebrafiskar och fathead minnow LC50-värden. Vi anser detta synsätt en användbar benchmarking-förfarande för beteendemässiga svar, särskilt när man jämför trösklar av specifika beteenden med en fisk modell över flera kemikalier. Det underlättar ytterligare beräkningar av akut till kronisk nyckeltal, som kan vara diagnostiskt användbar i vattenlevande toxikologi för mekanistiska studier och utvärderingar. LC50-värden erhölls från preliminära toxicitet bioassays standardiserade riktlinjer i steg 2.1.
I detta protokoll, vi anställer gemensamma experimentell design och statistiska metoder rekommenderas av US EPA och OECD standardiserade metoder för toxikologiska studier med fisk modeller. Även om vi rapportera p värden (t.ex., < 0,01, < 0,05, < 0,10), signifikanta skillnader (α = 0,10) i aktivitet identifieras nivåer bland behandlingar med variansanalys (ANOVA) om normalitet och likvärdighet av variansen antaganden är uppfyllda. Dunnetts eller Tukey's HSD post hoc-test utförs för att identifiera behandling nivåskillnader. Vi väljer denna alpha (α = 0,10) värde för att minska typ II fel, särskilt för tidig tier analyser och när en förståelse av biologiskt viktiga effekt storlek är begränsad för understudied beteende endpoints och modell organismer26, i stället för anställa förfaranden vanligare inom biomedicinsk vetenskap för multipla jämförelser (t.ex., Bonferroni korrigering för RNA-Seq data)27. Framtida studier behövs för att förstå variationer av dessa beteendemässiga svar och eventuellt ändra experimentell mönster (t.ex., öka replikering) därefter.
Ett antal faktorer kan påverka beteendet hos larver fisk förutom kemisk exponering. Exempelvis tiden av dagen, ålder, bra storlek, temperatur, ljusförhållanden och volym exponering lösning i varje väl representerar viktiga överväganden11,30. Av dessa skäl bör försiktighetsåtgärder vidtas för att minimera effekterna av externa faktorer som kunde påverka rörelseapparaten beteende av larval fisken under experiment. Beteendemässiga observationer bör utföras i smala tidsfönster (3 till 4 h) och över tidsperioder när tiden för dagen effekter förväntas ha minimal påverkan på larval rörelseapparaten beteende11. Larval fisk bör dessutom bibehållas vid en jämn temperatur (28 ± 1 ° C för zebrafisk) och 24 ± 1 ° C för FHM och på en definierad ljus/mörk cykel i temperaturreglerade inkubatorer under hela exponeringen. Temperaturen i laboratoriet där beteenden registreras bör dessutom bibehållas villkor tillnärma experimentella förhållanden att undvika temperaturpåverkan på beteenden. Ytterligare, brunnar används under beteendemässiga observationer bör behållas på en konsekvent volym för varje individuella fiskar.
Larver och embryonala zebrafiskar PMRs har tidigare använts i biomedicinsk vetenskap för att identifiera potentiella terapeutiska mål för romanen ämnen12,13. Detta protokoll expanderar på tidigare beteendevetenskaplig forskning med zebrafisk genom att utnyttja 38 slutpunkter för att undersöka kemiska bioaktivitet av miljöföroreningar. Även om koffein är en gemensam vattenlevande förorening med en förstås verkningsmekanism (MoA), saknar många föreningar i commerce viktiga mekanistiska data. Detta protokoll kan därför användas för att få inblick i MoAs för föreningar saknar toxicitetsdata, inklusive kommersiella kemikalier39. Protokollet ger dessutom metoder för två av de vanligaste fisk-modellerna. Som nämnts tidigare, medan zebrafiskar är en gemensam biomedicinsk fisk modell som blir allt populärare i ekotoxikologi, det fathead minnow används ofta som en ekologisk modell för miljöbedömning program men har fått jämförelsevis mindre uppmärksamhet i beteendevetenskapliga studier med automatiserade system jämfört med zebrafiskar. Men det finns fortfarande inga standardiserade regelverk metoder för fisk beteendemässiga toxikologistudier, ger detta protokoll en strategi för att stödja framtida insatser.
Koffein framkallade beteendemässiga svaren i varje fisk modell på nivåer som har upptäckts i vattenmiljön16. Rodriguez-Gil et al. 2018 utvecklat globala miljöexponering distributioner i akvatiska system baserat på uppmätta värden av koffein16. Specifikt, skulle 95% av förutsedd avloppsvatten avloppsvatten koncentrationer understiga LOECs för de mest känsliga beteendemässiga effektmåtten av zebrafisk och fathead minnow i den aktuella studien (tabell 2). Även om flera beteendemässiga effekter av koffein hos zebrafiskar (särskilt i mörka förhållanden) på miljömässigt relevanta nivåer, är det oklart huruvida dessa beteendemässiga förändringar kan uppstå i naturliga fiskbestånd eller resultera i ekologiskt viktiga negativa resultat. Även användbar för screening för känslig, diagnostiska ändamål, larval fisk beteendemässiga tröskelvärden inte företrädare för andra liv historia skeden eller fisk i naturliga populationer. Ytterligare forskning är befogad för att avgöra om liknande beteendemässiga svar trösklar skulle uppstå i naturen och vara vägledande för negativa resultat på enskilda eller befolkningen nivåer av biologisk organisation.
The authors have nothing to disclose.
Stöd för denna studie lämnades av US National Science Foundation (projekt nr: CHE-1339637) med ytterligare stöd från U.S. Environmental Protection Agency. Vi tackar Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket och Bridgett Hill för allmänna lab stöd.
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |