Vi præsenterer her, en protokol for at undersøge larve zebrafisk og bredhovedet elritse bevægeapparatet aktiviteter og photomotor svar (PMR) ved hjælp af en automatiseret sporingssoftware. Når de indgår i fælles toksikologi bioassays, giver analyser af disse adfærd et diagnostisk redskab for at undersøge kemiske bioactivity. Denne protokol er beskrevet ved hjælp af koffein, en model neurostimulant.
Fisk modeller og adfærd bruges i stigende grad på de biomedicinske videnskaber; fisk har dog længe været genstand for økologiske, fysiologiske og toksikologiske undersøgelser. Ved hjælp af automatiseret sporing af digitale platforme, nylige indsats i neuropharmacology løftestangsvirkningen larve fisk bevægeapparatet adfærd for at identificere potentielle terapeutiske mål for nye små molekyler. Svarende til disse bestræbelser, forskning i miljøvidenskab og sammenlignende farmakologi og toksikologi undersøger forskellige opførsler af fisk modeller som diagnostiske redskaber i differentieret vurdering af forurenende stoffer og real-time overvågning af overfladevand for forurenende trusler. Zebrafisk er en populær larve fisk model i de biomedicinske videnskaber, er tykhovedede elritse en fælles larve fisk model i økotoksikologi. Desværre har bredhovedet elritse larver fået langt mindre opmærksomhed i adfærdsmæssige undersøgelser. Her vi udvikle og demonstrere en adfærdsmæssige profil protokol bruger koffein som en model neurostimulant. Selvom photomotor svar af tykhovedede Elritser var lejlighedsvis påvirket af koffein, zebrafisk var markant mere følsomme over for photomotor og bevægeapparatet slutpunkter, som reagerede på miljømæssigt relevante niveauer. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at forstå sammenlignende adfærdsmæssige følsomhed forskelle blandt fisk med alder og tidspunkt på dagen, og til at afgøre, om lignende adfærdsmæssige virkninger ville forekomme i naturen og blive vejledende for negative resultater på enkelt eller befolkning niveauer i biologiske organisation.
Selvom fisk modeller bruges i stigende grad for biomedicinsk undersøgelser, har fisk været rutinemæssigt ansat i økologi og fysiologi undersøgelser, at undersøge forurening af overfladevand og forstå toksikologiske tærskelværdier for kemikalier. Disse bestræbelser er vigtigt, fordi kemiske forurening kan forringe akvatiske økosystemer og bringe kvaliteten af kilde vandforsyninger1,2. De fleste af kemikalierne inden for handel, men mangel på selv grundlæggende toksikologi information3.
Dyremodel assays traditionelt anvendes i lovgivningsmæssige toksicitetstest er ressourcekrævende og kan ikke levere den høje overførselshastighed, tidlig tier screening behov for toksicitet test i 214. Efterfølgende er der en voksende tilskyndelse til at vedtage og anvende in vitro- modeller, der kan mere hurtigt og effektivt skærmen forbindelser for biologiske aktiviteter3,5. Selv om celle-baserede modeller præsentere mange muligheder, de mangler ofte biologisk kompleksitet, og dermed højde ikke for mange vigtige hele organismen processer, herunder metabolisme6.
For zebrafisk er en fælles biomedicinsk dyremodel, der stigende popularitet som en alternativ model i akvatiske toksikologi og økotoksikologi7,8. I betragtning af deres lille størrelse, hurtig udvikling og høj frugtbarhed, kan fisk modeller anvendes til hurtigt og effektivt skærmen kemikalier til bioactivity og toksicitet på hele organismen skala9. Ved hjælp af automatiserede tracking software giver larve zebrafisk adfærd forbedrede diagnostiske nytte i screening forurenende stoffer for toksicitet10,11. Undersøgelser i de farmaceutiske videnskaber har vist at bevægeapparatet slutpunkter er informative af kemiske virkningsmekanismer, kan bruges til fænotype adfærd, og derefter kan forsøgsvis identificere subcellulært mål for nye molekyler12, 13. Zebrafisk er en populær larve fisk model i de biomedicinske videnskaber, tykhovedede elritse er en fælles, økologisk vigtige fisk model, der er brugt for økotoksikologi undersøgelser og under potentielle (f.eks. nye kemiske evalueringer) og retrospektiv (fx omgivende overfladevand eller spildevand spildevand decharge overvågning) miljøvurderinger. Desværre har adfærdsmæssige reaktioner af larve tykhovedede Elritser fået markant mindre opmærksomhed end zebrafisk. Vores igangværende forskning med to fælles larve fisk modeller, zebrafisk og bredhovedet Elritse, tyder på, at larver fisk svømmer mønstre vises unikke forventede tilstande eller virkningsmekanismer for forskellige kemikalier. Adfærdsmæssige slutpunkter giver således, potentiale til at hurtigt og fornuftigt undersøge kemikalier til toksicitet og identificere subcellulært mål for industrielle kemiske og andre kontaminanter, især i begyndelsen tier vurderinger.
Her rapporterer vi en protokol for behandlingen af adfærdsmæssige reaktion profiler i larve fisk. Vi demonstrere disse metoder, koffein, en model neurostimulant og en fælles akvatiske forurenende stof, der er introduceret til akvatiske systemer gennem udledning af spildevand behandlinger planter efter menneskers indtagelse af fødevarer, drikkevarer, og Pharmaceuticals formuleret med koffein14. Vi undersøger adfærdsmæssige reaktioner på koffein i begge larve zebrafisk og bredhovedet Elritse, herunder at en pludselig ændring i lysforhold, der ofte omtales som en photomotor reaktion (PMR) under farmaceutiske studier med embryonale og larve zebrafisk13,15. Vi yderligere at identificere virkningerne af koffein på tværs af flere bevægeapparatet slutpunkter til at udvikle kemiske reaktion profiler for hver fisk model. Koffein behandling niveauer anvendes i denne undersøgelse repræsenterer den øvre centiles af eksponering distributioner baseret på målte miljømæssige værdier af koffein16. Vi har desuden behandlinger benchmarkes larve fisk LC50 værdier og terapeutiske hazard værdi (THV), en farmaceutisk koncentration i vand, som forventes for at resultere i plasmaniveauer i fisk i overensstemmelse med en plasma fra mennesker terapeutiske dosis.
Når du vælger kemisk behandling niveauer for adfærdsmæssige toksikologiske undersøgelser, skal flere faktorer overvejes. Koffein behandling niveauer i den foreliggende undersøgelse blev udvalgt på grundlag af øvre centile værdier for forventede miljømæssige eksponeringsscenarier fra spildevand spildevand16. Når det er muligt, vælger vi rutinemæssigt behandling niveauer for akvatiske toksikologiske undersøgelser ved hjælp af probabilistiske eksponering vurderinger af miljømæssige bemærkninger19,20,21. En THV, som er beregnelig for lægemidler, blev også medtaget som et behandling niveau i den foreliggende undersøgelse. THV værdier (Eq. 1)22,23 defineres som forudsagt vand koncentrationer fører til menneskelige terapeutiske doser (Cmax) af lægemidler i fisk23, er inspireret fra første plasma modellering indsats24, og er beregnet på grundlag af blod: vand kemisk partitionering koefficienter (Eq. 2)25.
THV = Cmax / log PBW (Eq. 1)
Log PBW = log [(100,73. log Kow · 0,16) + 0,84] (Eq. 2)
Her vælger vi også subletale behandling niveauer i forhold til zebrafisk og bredhovedet elritse LC50 værdier. Vi betragter denne tilgang en nyttig benchmarkingprocedure for adfærdsmæssige reaktioner, især når man sammenligner tærskler for specifikke adfærd med en fisk model på tværs af flere kemikalier. Det letter yderligere beregninger af akut til kronisk nøgletal, som kan være diagnostisk nyttige i akvatiske toksikologi Mekanistiske undersøgelser og vurderinger. LC50 værdier blev indhentet fra indledende toksicitet bioassays efter de givne i trin 2.1 standardiserede retningslinjer.
I denne protokol, vi anvender fælles eksperimentelle design og statistiske teknikker anbefales af US EPA og OECD standardiserede metoder for toksikologi undersøgelser med fisk modeller. Selvom vi rapportere p -værdier (fx., < 0,01, < 0,05, < 0,10), betydelige forskelle (α = 0,10) i aktivitet niveauer er identificeret blandt behandlinger ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) Hvis normalitet og ligestilling af variansen antagelser er opfyldt. Dunnetts eller Tukey's HSD post hoc test udføres for at identificere behandling forskelle. Vi vælger denne alpha (α = 0,10) værdi at reducere type II fejl, især for tidligt tier assays og hvornår en forståelse af biologisk vigtig effekt størrelse er begrænset til forsømt adfærdsmæssige slutpunkter og model organismer26, i stedet for beskæftiger procedurer mere almindelige i biomedicinsk videnskab for flere sammenligninger (fx., Bonferroni korrektion for RNA-Seq data)27. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at forstå variabiliteten af disse adfærdsmæssige reaktioner og potentielt ændre eksperimentelle design (fx, øget replikation) i overensstemmelse hermed.
En række faktorer kan påvirke adfærd af larve fisk ud over kemiske eksponering. For eksempel, tid på dagen, alder, godt størrelse, temperatur, lysforhold, og mængden af eksponering løsning i hver godt repræsenterer vigtige overvejelser11,30. Af disse grunde bør der tages forholdsregler til at minimere virkningen af eksterne faktorer, der kan påvirke bevægeapparatet opførsel af de larve fisk under eksperimenter. Adfærdsmæssige observationer skal udføres i smalle tidsvinduer (3 til 4 h) og på tværs af tidsperioder Hvornår tid af dagen virkninger forventes at have minimal indflydelse på larve bevægeapparatet adfærd11. Derudover bør larve fisk opretholdes, ved en ensartet temperatur (28 ± 1 ° C for zebrafisk) og 24 ± 1 ° C for FHM og på en defineret lys/mørke cyklus i temperatur-kontrollerede væksthuse i hele perioden eksponering. Derudover kan opretholdes temperaturen i laboratoriet hvor adfærd registreres betingelser tilnærme forsøgsbetingelser at undgå temperatur påvirkninger på adfærd. Yderligere, kan opretholdes brønde anvendes under adfærdsmæssige observationer på en sammenhængende volumen for hver enkelt fisk.
Larver og embryonale zebrafisk PMRs har tidligere er blevet anvendt i de biomedicinske videnskaber til at identificere potentielle terapeutiske mål om roman forbindelser12,13. Denne protokol udvider på tidligere adfærdsforskning med zebrafisk ved at udnytte 38 slutpunkter for at undersøge kemiske bioactivity af miljøforurenende. Selv om koffein er en fælles akvatiske forurenende stof med en forståelig virkningsmekanisme (MoA), mangler mange forbindelser i commerce vigtige mekanistiske data. Derfor, denne protokol kan anvendes til at få indsigt i MoAs for forbindelser mangler toksicitetsdata, herunder kommercielle kemikalier39. Derudover indeholder protokollen metoder for to af de mest almindeligt anvendte fisk modeller. Som nævnt tidligere, mens zebrafisk er en fælles biomedicinsk fisk model, der bliver stadig mere populære i økotoksikologi, tykhovedede elritse er almindeligt anvendt som en økologisk model for miljøvurdering programmer men har modtaget forholdsvis mindre opmærksomhed i adfærdsmæssige undersøgelser med automatiserede systemer i forhold til zebrafisk. Selv om der ingen standardiseret lovgivningsmæssige metoder til fisk adfærdsmæssige toksikologiske undersøgelser, giver denne protokol en tilgang til at understøtte fremtidige bestræbelser.
Koffein fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner i hver af fisk modellerne på niveauer, der er blevet påvist i vandmiljøet16. Rodriguez-Gil et al. 2018 udviklet globale miljøeksponering distributioner i akvatiske systemer baseret på målte værdier af koffein16. Specifikt, ville 95% af forventet spildevand spildevand koncentrationer falde under LOECs for de mest følsomme adfærdsmæssige slutpunkter for zebrafisk og bredhovedet elritse i den nuværende undersøgelse (tabel 2). Selvom flere adfærdsmæssige virkninger af koffein blev observeret i zebrafisk (især i mørke omgivelser) på miljømæssigt relevante niveauer, er det uklart, om disse adfærdsmæssige ændringer kan forekomme i naturligt fiskebestande eller resultere i økologisk vigtige negative resultater. Selvom nyttigt for følsomme, diagnostisk screening formål, være larve fisk adfærdsmæssige tærskler ikke repræsentant for andre livshistorie faser eller fisk i naturlige populationer. Yderligere forskning er berettiget til at afgøre, om lignende adfærdsmæssige reaktion tærskler ville forekomme i naturen og være vejledende for negative resultater på de enkelte eller befolkning niveauer i biologiske organisation.
The authors have nothing to disclose.
Support af denne undersøgelse blev leveret af den amerikanske National Science Foundation (projekt #: CHE-1339637) med yderligere støtte fra det amerikanske Environmental Protection Agency. Vi takke Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket og Bridgett Hill for generelle lab støtte.
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |