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方法論記事

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

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DOI:

10.3791/57949

2018年6月21日

この記事について

サマリー

リーフ スプレー質量分析は、サンプルの準備を最小限に抑え、排除クロマトグラフィー、小分子植物組織からの迅速な検出を可能にする直接の化学分析手法です。

要約

植物は、その化学的性質の多様である小分子の数千を生成します。質量分析 (MS) は、高い感度と特異性の分子量であるため植物代謝産物の分析のための強力な手法です。リーフ スプレー MS は、エレクトロ スプレー、クロマトグラフィー プロセスから排除することを介して直接化学分析用植物組織が使用されている周囲のイオン化技術です。代謝物質を抽出するこの方法は、同時に必要な試料の量を最小限に抑え、そのまま植物組織から検出される幅広い化学の授業にできます。高解像度、正確な質量 MS に使用する時リーフ スプレー MS 興味の代謝物の迅速な検出を容易に。また、化合物の同定を容易にするためにこの手法を持つタンデム質量断片化データを収集することが可能です。正確な質量測定と断片化の組み合わせは、化合物の id を確認するのに有益です。リーフ スプレー MS 技術は nanospray イオン源のごく一部だけを必要とし、さらに質量分析計の機能を拡張する有用なツールです。ここでは、セレチウム tortuosum (Aizoaceae)、南アフリカ共和国から伝統的な薬用植物から新鮮な葉組織を分析します。多数の mesembrine アルカロイドは、リーフ スプレー MS で検出されます。

概要

植物には、多様な化学的性質を持つ小さな分子の広い範囲が含まれています。MS はそれは代謝産物1の同定のため高い感度と特異性の元素組成を提供できるため、植物の化合物を分析するための強力な手法です。最も一般的に、MS は MS 分析1前クロマトグラフィーによる分離溶媒抽出のサンプルで実行されます。しかし、液体クロマトグラフィー (LC) の使用は長い解析時間を必要とする、広範なサンプル準備1に関連付けられて多くの場合。対照的に、クロマトグラフィーを回避、そのまま組織の直接の化学分析は非常に急速な技術は、最小限のサンプル準備2が必要です。したがって、ガスクロマト グラフの手順を実行することができます forgone する場合、直接の化学分析は非常に有利なすることができます。

自然な製品とメタボロミクス研究のための典型的な LC MS は、複数の組織や細胞の種類3を含む乾燥または冷凍植物材料の長い一括抽出に依存します。また、植物組織の代謝物 MS 検出などの直接の化学分析は種類の細胞を分離し、避ける準備アイテム4できます。リーフ スプレー MS、組織スプレー5

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プロトコル

1. 葉の Nanospray ソースに変更スプレー MS

  1. リーフ スプレー MS に変更した nanospray ソースを使用します。流体部品をリーフ スプレー MS に必要なしと、ソースを変更するには、ソースから LC プローブを削除します。
  2. ソースに接続するための適切なピンと植物組織に電圧を適用するリーフ スプレー MS ワイヤを組み立てます。絶縁線; の一方の端にピンをはんだ付けワイヤーの反対側の端にクランプをはんだ付けします。
    メモ: クランプ (ワニ口クリップ タイプ) には、歯がない可能性があります。小さい組織、歯なしクランプが適しています。クランプで省略可能なフレックス アームは、植物組織の配置を支援する nanospray のソースに追加可能性があります。注このプロトコルは、具体的には、ハイブリッド四重極イオン トラップ質量分析計 MS システムでリーフ スプレー MS を実行する方法を記述 (材料の表を参照)。ただし、このテクニック6を実行する他の MS のシステム改変すること。リーフ スプレーをカップリング ポータブル質量分析計のリアルタイム分析と MS 実行できます敷地内研究室19,20植物材料を輸送する必要なし。
  3. 放電の高電圧を使用する場合は、....

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結果

10 週間後の発芽、新鮮の温室栽培の米 tortuosumの葉で葉スプレー MS によって分析されました。S. tortuosumからの代謝物を検出するための実験的ワークフロー葉リーフ スプレー MS は図 2に示します。葉を選択、ポイントを形成するテーパー エンドの薄いストリップにカット、リーフ スプレー MS ワイヤー クランプ装置で固定します。イオンの入口から、x 軸と y 軸に沿って、植物組織は 〜 30 ミリメートルを配置されました。S. tortuosumの MS 葉リーフ スプレーの開始時に任意の溶媒のアプリケーションがなくてもイオンが検出されました。セレチウム科の植物は、エレクトロ スプレー イオン化の溶媒の外部アプリケーションがなくてもリーフ スプレー MS により高含水比厚い葉の多肉植物です。ただし、通常は、植物組織はイオンを検出する溶媒アプリケーションする必要があります。

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ディスカッション

このプロトコルの使用の成功は、植物の種、組織型、および興味のターゲット化合のさまざまな段階の最適化に依存します。プロトコルに記載されているパラメーターは、良い出発点を提供します。作られ、テストする必要があります次の実験的決定: かどうか使用 (1) カットまたはノーカットの組織、(2) 溶剤溶剤は、(3) どのような溶媒を使用してどのくらいのボリュームで、(4) イオン入口から組織の距離ものがあります、(5) と電圧振幅。最適化の目的が続く場合は、少なくとも 30 連続信号を生成する条件を見つけるため、数分に s。条件は、正確な質量と MS/MS 測定を実行するために必要な適切かつ再現可能な信号の強度を提供しなければなりません。高い信号強度は、組織からのイオンの成功し、信頼性の高いスプレーを介して達成されます。スプレー品質、組織及びイオン導入口の先端と電気の電圧との間の距離、イオン入口に向かって指している組織の先端の鋭さに依存します。成功したスプレーが組織の先端のポイントの鋭さに大きく依存して、いくつかのケースで、先の尖った先端を形成する組織を切られるべき。特に、切断組織の先端のテーパ形状の角度の鋭さのわずかな変化はイオン化の結果の品質.......

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、NSF 植物ゲノム研究プログラム助成 IOS 1238812 と員生物 IOS-1400818 によって賄われていた。仕事もキャサリン A. サモンズにモンサント社の大学院学生団体によって資金を供給されました。フルブライト アフリカ研究者学者プログラム (2017-2018) が Nokwanda P. Makunga に与えられる資金の感謝の意を。ジェシカの Prenni からの nanospray ソースの寄付、コロラド州立大学でプロテオミクスとメタボロミクスの設備をお願い申し上げます。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
接続ピンDigi-Key elctronicsWM2563CT-NDピンは、電圧を提供するThermo Scientificソースに挿入されます
クランプDigi-Key elctronics314-1018-NDクリップマイクロアリゲーター銅 5A
大きなクランプDigi-Key Elctronics290-1951-NDワニ口クリップナローニッケル5A
熱収縮Digi-Key ElctronicsQ2Z1-KIT-NDカバーはんだ付けジョイント
NSIソース ナノスプレーイオン源サーモサイエンティフィックNAサーモ機器を使用していない場合は、別のブランドが機能します
Q Exactive-ハイブリッド四重極 オービトラップサーモサイエンティフィックNAサーモ機器を使用していない場合でも、別のブランドが機能します
Tuneソフトウェアサーモサイエンティフィックモ機器
Xcalibur SoftwareThermo scientific
Plant of interest - S. tortousum
小さな サーを使用していない場合は、別のブランドが機能します

参考文献

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass s....

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再版と許可

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