Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Resumo

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Introdução

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições^1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identif....

Protocolo

1. equipamento fabricação e montagem de aparelhos para ensaios de gradientes

1. Fabrica as placas de ensaio de alumínio para o ensaio de gradiente de single-direcional.
   1. Cortar e moer cada placa de ensaio de alumínio (figura 1A) fora de uma única peça de alumínio usando uma serra de fita e afiadas moinho vertical com as seguintes dimensões: o tamanho exterior é 140 x 100 x 9 mm e o tamanho interno é de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodiza dentro de cada placa de ensaio com tinta preta para tornar mais fácil para visualizar as larvas e evitar ferrugem.
      Nota: A fabricação das placas de ensaio d....

Resultados

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase li.......

Discussão

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
aparelho de ensaio de gradiente
PolyScience 9106, Banheira de Circulação Refrigerada/Aquecida 6L	Thomas Scientific	9106	Este modelo foi descontinuado. Os modelos de substituição atualizados incluem: 1186R00 e 1197U04 para 120 V, 60 Hz ou 1184L08 e 1197U04 para 240 V, 50 Hz.
Placa de ensaio de alumínio (para gradiente direcional único)			Tamanho externo: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamanho interno: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado preto.
Placa de alumínio (para gradiente bidirecional)			25 x 22 x 0,2 cm, anodizado preto.
Bloco			Tamanho externo: 25,5 x 5 x 1,4 cm, os parâmetros dos canais internos são mostrados na Figura 1D.
Conector para blocos e tubos de alumínio	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" parede
Nome	Empresa<	strong>Número de Catálogo	Comentários
Items e reagentes para ensaio
Pestle	USA Scientific	17361	Pilão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL
Termômetro	Termopar Fluke	51II
	Fluke	K tipo
Tampa de microplaca universal	Corning	6980A77
Prato de 35 mm	Corning	9380D40
Fita de rotulagem (para gradiente bidirecional)	Fisher Scientific	15-951	Fita de rotulagem Fisherbrand 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare a solução a 1%
Sucrose		Sigma S0389-5KG	Prepare a solução a 18% logo antes de iniciar o ensaio
Pincel	Fisher Scientific	11860
Tubos de	centrífuga de 50 mLDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
Garrafa redonda de boca larga de 500 mL	Pyrex	1395-500
Filtro de células (poro de 300 mm)	PluriSelect	43-50300	Item opcional para lavagem de larvas
Caixa de papelão (bandeja de frasco)	Genesee Scientific	FS32-124
Nome	Company	Número de catálogo	Comentários
Drosophila food
destilada			22.400 mL
Fubá, amarelo (malha extra fina, flocado) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1.609 g
de levedura de cerveja 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Farinha de soja (10 kg/unidade)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Ágar, Tipo II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
de xarope de milho leve Karo	Karo		1.700 mL
de 4-hidroxibenzoato de metila (suspender em etanol de prova 200)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Puriss de ácido propiônico. p.a.,>99,5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Ácido fosfórico  Reagente ACS, ≥ % em peso de 85 em H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8,5 mL

de alumínio Água