Vi presenterar ett protokoll för att mäta syreförbrukning och extracellulära försurning i Drosophila melanogaster larver och vuxna hjärnor. En metabolisk analyzer används med en anpassad och optimerad protokollet. Micro-vävnad begränsningar var är en kritisk komponent i detta protokoll och designad och Skapad speciellt för deras användning i denna analys.
Det här protokollet beskriver en metod för att mäta metabolismen i Drosophila melanogaster larver och vuxna hjärnor. Kvantifiera ämnesomsättningen i hela organ ger en vävnad-nivå förståelse för energiutnyttjande som inte kan registreras när analysera primära celler och cellinjer. Denna analys är ex vivo, det möjliggör mätning från ett antal specialiserade celler arbetar tillsammans för att utföra en funktion i en vävnad och modeller närmare i vivo orgeln. Metaboliska omprogrammering har observerats i många neurologiska sjukdomar, inklusive neoplasi och neurodegenerativa sjukdomar. Detta protokoll har utvecklats för att hjälpa D. melanogaster gemenskapens undersökning av metabolism i neurologiska sjukdomsmodeller använder en kommersiellt tillgänglig metabola analyzer. Mäta metabolismen av hela hjärnor i metabola analysatorn är utmanande på grund av geometri av hjärnan. Denna analysator kräver prov kvar på botten av en plattan med 96 brunnar. Cellprover och vävnad stämplingar kan följa ytan av cell plattan eller utnyttja sfäroid plattor, respektive. D. melanogaster hjärnor sfäriska, tredimensionell form hindrar dock vävnaden från klibba till plattan. Detta protokoll kräver ett speciellt konstruerade och tillverkade mikro-vävnad återhållsamhet som kringgår detta problem genom att förhindra någon rörelse i hjärnan samtidigt tillåta metabola mätningar från analysatorns två solid-state sensor sonder. Syreförbrukning och extracellulära försurning priser är reproducerbara och känslig behandling med metaboliska hämmare. Med en mindre optimering, kan detta protokoll anpassas för användning med alla hela vävnad och/eller modellsystem, förutsatt att stickprovets storlek inte överstiger kammaren genereras av fasthållningsanordningen. Medan basala metaboliska mätningar och analys efter en behandling med mitokondrie-hämmare beskrivs i detta protokoll, kunde otaliga experimentella förhållanden, såsom energi källa preferens och uppfödning miljö, förhöras.
Metaboliska omprogrammering har upptäckts i många neurologiska sjukdomar, inklusive Glioblastoma Multiforme (GBM), Huntingtons sjukdom och stora depressiv störning (MDD)1,2,3. Som metabolismen blir fokus för terapeutiska strategier, avancerade verktyg för grundläggande metabolisk forskning. Emellertid var de flesta av dessa metoder för att studera cellinjer och primära celler eller för att analysera större vävnader efter fixering eller -frysning. Vissa metoder har förlitat sig på kit att förenklat mäta specifika metaboliter, medan andra har utnyttjas mer kostsamma och komplexa analyser utnyttja kromatografi i kombination med masspektrometri4 för samma mål. För att förstå det största metabola landskapet, metabolisk profilering5,6 och metabola flux analys (MFA)7 framkom för att komplettera storskaliga proteomiska och genomisk studier. Profilering ger en kvantitativ representation av metaboliter i en cell eller vävnad vid ett tillfälle i tid, medan MFA utökar detta genom att tillåta spårning av märkta metaboliter över tid. Den senare har varit användbar i avslöjar hur energikällor utnyttjas på olika sätt i en cell eller vävnad när i en sjukdom stat8. Dessa metoder omfattar dock inte mätning av den totala ämnesomsättningen.
För att förhöra totala metaboliska tillståndet för de små modellsystem, kan traditionella metoder, såsom Clark elektrod9 och indirekt kalorimetri10, användas för att mäta syreförbrukning eller konfigurerats för stoppa flödet respiration, till mäta syre och koldioxid koncentration, respektive. Dessa tekniker, har medan exakt ger inblick i avläsningen av metabola omprogrammering på organismnivå, begränsningar. Användning av Clark elektroden kan vara tekniskt utmanande och är inte avsedd för hög genomströmning studier. Respirometer med stopp i flödet fungera inte med den känslighet som krävs till assay celler eller vävnader. Flera år sedan, har ny teknik utvecklats speciellt för dessa mindre program11. Dessa instrument var ursprungligen tänkt att mäta syreförbrukning och extracellulära försurning av cellinjer och primära celler i en 24 – eller 96-bra format. Enkelheten i set-up och data utdata etablerat denna metod som ett alternativ till de traditionella metoderna. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för celler och senaste framsteg har gjort för mätning av vävnad stämplingar12,13,14. De metoder som används i dessa analyser tillåter dock inte för mätning av hela organ från små modellsystem.
Metabolisk analys av sjukdomsmodeller innebär ofta samverkan mellan celler specialiserade funktion som är bosatta inom samma vävnaden. Exempelvis producera gliaceller metaboliter som utnyttjas av nervceller. Dessa metaboliska interaktioner krävs för neuronal överlevnad15. Liten modellsystem är fördelaktiga för att utreda frågor som dessa. Studier för att mäta metabolismen av en hel orgel, som innehåller en mängd olika celltyper, kommer att lägga till förståelsen av energi utnyttjande i vivo. Becker et al. rapporterade nyligen, en metod att mäta syreförbrukningen i hela flyga huvuden16. Genom att samla ett antal huvuden tillsammans i en väl 24-väl cell platta, erhölls syre förbrukning avläsningar använder en metabolisk analyzer. Även detta fungerar bra för huvuden, som skiljs lätt från kroppen, är det mycket svårare att använda för organ såsom larver hjärnor, eftersom en stor mängd behöver vara dissekeras för denna metod. Därför utvecklades en metod som utnyttjar en cell plattan med 96 brunnar, vilket ökar känsligheten av syreförbrukning och extracellulära försurning avläsningar, för att assay en enda hela larval hjärna.
Den metabola analyzer används i denna studie kräver provet mäts för att ligga kvar på botten av brunnen av en plattan med 96 brunnar i cellen. För celler och relativt platt vävnader är detta inte en utmaning; dock för D. melanogaster larver och vuxna hjärnor är det inte möjligt med traditionella platta beläggning protokoll. Det sfäriska tredimensionella formen av hjärnor kommer inte tillförlitligt följer den platta ytan, och de som gör skadas ofta vid försök att placera dem ordentligt i brunnen. En viktig del av detta nya protokoll är design och utveckling av mikro-vävnad begränsningar17 som ger en liten kammare för hjärnan att vistas i utan att störa de metabola mätningarna. Kammaren genereras är ungefärligt 0,016 i höjd och ger tillräckligt utrymme för att enkelt hålla många D. melanogaster hjärnor. Begränsningarna som består av nylon mesh bifogas en inert polymer ring och kommer att diskuteras ytterligare i Representativa resultat. Med dessa begränsningar minimerar tiden det tar att förbereda dissekerade hjärnor för metabola mätning. Optimera mäta förfarandet genererar stadig, reproducerbara syreförbrukning och extracellulära försurning priser efter sex mätning cykler (25 min). Hjärnor fortfarande metaboliskt aktiva under dessa förhållanden i minst 2 h, vilket gör injektioner av therapeutics, -hämmare eller andra behandlingar via metabola analyzer patron drogen leverans hamnarna. Detta protokoll kan också enkelt anpassas för andra vävnader och liten modell system18.
Protokollet beskrivs nedan beskriver hur till assay syreförbrukningen i en hela Drosophila larval hjärnan när utmanas med mitokondriell stress. Stress hjärnan, läggs oligomycin till hämma ATP synthase19. Minskningen i syreförbrukning från basal avläsningar visar en mätning av mängden ATP-beroende andning i hjärnan. Ytterligare sänkningar av syreförbrukningen efter behandlingar med rotenon20 och antimycin A21, hämmare av elektrontransport kedja komplex I och III, respektive, ange mängden icke-mitokondriell syreförbrukning i den hjärnan. Denna analys är ett exempel på hur mitokondriernas andning i en flyga hjärna kan jämföras och hur detta protokoll kan användas för att jämföra metabolismen i olika genotyper. Detta protokoll kan dock anpassas för att mäta bara basala syreförbrukning och extracellulära försurning priser, samt att utforma noggrannare studier som undersöker särskilda energiutnyttjande eller substrat utnyttjande hypoteser.
Här beskrivs en ny metod för metabolisk analys av D. melanogaster larver och vuxna hjärnor ex vivo . Under basala förhållanden anger syreförbrukning och extracellulära försurning priser hur metaboliskt aktiva hjärnan är och kan avgöra om en vävnad har blivit mer beroende av mitokondriell kontra glycolytic respiration, respektive11.
Behandling av hjärnor med hämmare eller terapeutiska läkemedel kan ge ytterligare information om metabolisk status av vävnad. Metaboliska substrat kan också läggas för att avgöra beroenden på specifika metaboliter, såsom glukos att testa för Warburg effekt22 eller glutamin att undersöka glutaminolysis23— båda common i metabola omprogrammering. För långsiktiga studier, larver eller flugor kan också matas droger istället för att använda injektion hamnar, och hjärnor kunde analyseras vid intervaller eller vid slutpunkten, beroende på experimentell design. Denna metod kan optimeras för många applikationer.
Denna metod har optimerats för hjärnor men kan användas för att analysera andra larver18 och vuxna vävnader. Dessutom kan andra små modellsystem använda denna metod för att mäta hela organismer18 eller vävnader. Den enda begränsningen att optimera denna metod för andra system är storleken av organ, vävnad eller organism. Kammaren skapad av mikro-vävnad fasthållningsanordningen är storlek barriären att köra analysen. Om metabola utdata är för låg för hjärnan eller vävnad som testas, och urvalets storlek är inte en begränsning, kan samla prover användas för att öka assay mätningar och känslighet. Ändra detta protokoll för andra program bör endast kräva mindre optimeringar, inklusive (1) att välja en lämplig åtgärd och blanda cykel nummer och timing, och 2) att fastställa effektiva behandlingen koncentrationer för vävnaden. Åtgärden och blandande gånger bestämdes genom övervakning syrekoncentrationen mätt i metabola Analyzer under varje cykel. Detta kan ses genom att välja O2 i Y2 axeln knappen i översiktsfönstret när körningen är klar. Under varje cykel, bör det finnas en drop-in syrekoncentration återspeglar den Tissues syreförbrukning under den uppmätta tiden, följt av en återgång till den ursprungliga syrekoncentrationen under skakningen. De mån och mix tiderna bör testas tills detta mönster har observerats. Med den här metoden, har andra insekt hjärnor studerats. Dessa hjärnor var större än flyga hjärnor används här men fortfarande passar i kammaren genereras av vävnad fasthållningsanordningen. OCR avläsningarna från dessa hjärnor var så hög som 400 pmol/min (inga data anges). Resultaten från dessa studier, samt OCR-priser som är i linje med andra studier som mäter hela-fly syre förbrukning18,24, tyder på att D. melanogaster hjärnor inte syre-begränsad. För både D. melanogaster hjärnor och vävnader från andra organismer kräver tillämpa denna metod särskild uppmärksamhet åt fyra kritiska steg.
För att framgångsrikt uppnå reproducerbara och biologiskt relevanta mätningar, finns det kritiska steg i protokollet som måste följas. Första krävs användningen av en fasthållningsanordning för mikro-vävnad för denna metod. Tillverkning av dessa begränsningar med hjälp av specifikationer och material är viktigt. Material valdes på grund av sin inert kemiska sammansättning och deras förmåga att tillåta korrekt media exchange under blandning stegen utan skapandet av luftbubblor. Andra, en läglig dissektion och plattan förberedelse krävs att maximera metabola utdata av vävnad. Kort dissektion gånger bör inte avsevärt försämrar hjärnan. Andra studier har visat att flyga hjärnor kan hållas vid liv i timmar till dagar efter dissektion om korrekt lagras i en perfusion kammare25. Som kan ses i figur 3B och 3D, om hjärnor är kvar sitter i assay media under lång tid före analysen, minskade dock de syre förbrukning. Under analysen genomgå prov en blandande steg under varje cykel. Denna blandning inte bara aids med injektioner av kemiska föreningar men också verkar för att återcirkulera media och ger syre. Hjärnan kan bo metaboliskt aktiva under längre perioder under dessa mått-blandning cykler än de skulle inkubation i media bänk längst upp. Därför bör dissektion av larval hjärnor bemästras innan du börjar ställa in denna analys. När inställningen upp denna analys, analysera ett litet antal genotyper samtidigt, för att minimera antalet hjärnor behövs och brunnar utnyttjas. Detta kommer att förhindra fördröjningar mellan den dissekera och assay mätningarna. För det tredje, att upprätthålla en stabil temperatur krävs att analysera de metabola priserna i fysiologiskt relevanta villkor. Ökad assay temperaturer kan orsaka vävnadsdöd, observeras av lägre syre förbrukning (figur 3 c). Om flugor föds vid annan temperatur i experimentsyfte, bör mätningarna också utföras vid denna temperatur. Medan dissektioner kommer sannolikt utföras vid rumstemperatur, om analysen kommer att genomföras vid annan temperatur, bör guldpläterade och återhållsam hjärnor inkuberas vid önskad temperatur för 15 min innan du kör analysen. Slutligen, Observera brunnar efter analysen är avgörande för att fastställa om vävnad positionering påverkat mätningarna. Ibland blir det en avvikare väl som, efter att observera plattan under dissekera mikroskopet, kan elimineras från dataanalysen på antingen förlust av vävnad eller mispositioning, där hjärnan har halkat ur centrum av brunnen och fastnar under polymer ringen av fasthållningsanordningen. Vävnaden kan förloras om fasthållningsanordningen säkrades inte korrekt till brunnen och stördes under blandning cyklerna. Medan ingen av dessa händelser händer ofta, om de inte är undantagna från analysen, kommer de lägre ränta värdena väsentligt.
Mätning av hela-vävnad metabola flux av övervakning syreförbrukning och extracellulära försurning ger en biologiskt relevanta metod för att förstå hur ämnesomsättningen påverkas av genetiska landskapet eller andra experimentella villkor. Denna metod är tillräckligt känslig för att upptäcka metaboliska förändringar i en enda D. melanogaster hjärnan, vilket inte är möjligt med stop-flow respiration eller indirekt kalorimetri. Det är också mindre tekniskt utmanande än att använda en Clark elektrod mäta syreförbrukning. Ytterligare en fördel med detta protokoll är förmågan att analysera en hela hjärnan per brunn. 96-väl formatet tillåter känsligare avläsningar, och således mer än en genotyp kan analyseras i taget på grund av det mindre antalet prover krävs per analys. Även mäta metabolismen i vävnad är fortfarande utmanande och kräver noggrant uppfödda och synkroniserade djur, detta protokoll beskriver en snabb, relativt förenklad metod, och har potential att analysera många metaboliska känslighet i D. melanogaster larver och vuxna hjärnor.
The authors have nothing to disclose.
Aktier som erhållits från Bloomington Drosophila lager Center (NIH P40OD018637) användes i denna studie. Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av institutionella Development Award (IDeA) nätverket för biomedicinsk forskning Excellence från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under licensnummer P20GM103430, och av stiftelsen Rhode Island. Författarna tackar J. vatten och P. Snodgrass-bälte för deras stöd i utvecklingen av detta protokoll.
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |