Här presenterar vi ett protokoll för bänkmonterade orörlig metall affinitet kromatografi rening och efterföljande beredning av en polyhistidine taggade, icke-heme iron bindande dioxygenas lämplig för grundutbildning laboratoriet.
Bänkmonterade orörlig metall affinitetskromatografi (IMAC), av polyhistidine taggade proteiner styras lätt av studenter och har blivit den mest använda protein rening metoden i den moderna litteraturen. Men tillämpningen av affinitetskromatografi på metall bindande proteiner, särskilt de med redox känsliga metaller såsom järn, är ofta begränsade till laboratorier med tillgång till ett handskfacket – utrustning som inte rutinmässigt finns i på grundnivå laboratorium. I denna artikel visar vi våra bänkmonterade metoder för isolering, IMAC rening och metall-Jon beredning av en poly-histidin taggade, redox-aktiva, icke-heme iron bindande extradiol dioxygenas och analysen av dioxygenas med varierande substrat koncentrationer och mättar syre. Dessa metoder är utförda av studenter och genomförs i grundutbildningsprogram undervisning och forskning laboratorium med instrumentering som är tillgängliga och överkomliga vid primärt grundutbildningsprogram institutioner.
De första rapporterna av rening av en polyhistidine taggade protein från extrakt av en värdorganism med kelering av taggen histidin genom en immobiliserade metall in litteraturen i 19881,2. Sedan dess har tillägg av polyhistidine taggar till rekombinanta proteiner och deras rening av immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC) har blivit praktiskt taget överallt i biokemisk litteratur3,4, 5. IMAC reningsmetoder kan genomföras på de bänkmonterade, använder automatiserad jonkromatografi och i spin-kolumnen format. Medan affinitet reningsmetoder, särskilt IMAC, används allmänt i forskningslaboratoriet, är de mindre vanliga i grundutbildning laboratorium. De mest använda laboratorium läroböckerna för biokemi laboratorium undervisar inte rutinmässigt dessa metoder, i stället väljer för mer traditionella jonbyte eller dye-bindande kromatografi6,7,8 , 9. exempelvis rening av laktatdehydrogenas av Anderson10 använder affinitet av färgämne-bindning, och rening av mjölk från nötkreatur α-mjölkalbumin7,11 av Boyer använder ett nickel-nitriloacetic sura matrix, men ingen rekombinant poly-histidin-tagg, förlitar sig istället på inneboende affinitet av protein för harts. Vissa moderna grundutbildningsprogram laboratorium läroböcker och publikationer genomför immobiliserade metall affinitetskromatografi på poly-histidin taggade protein mål såsom grön eller röd fluorescerande proteiner12,13, 14,15, antikroppar16och valda enzymer17,18,19,20, även några av okänd funktion21. Utan tvekan, rening av ett enzym som är att föredra i laboratoriet undervisning eftersom målet kan vara analyseras för verksamhet i efterföljande sessioner, berika upplevelsen av ”verklig vetenskap” hos studenten; Ja, dessa typer av laboratoriet upplevelser har publicerats och gynnsamma resultat på elevernas lärande rapporterade17,18,20,21. Och ännu, tillämpningar av IMAC till enzymet rening i biokemi undervisning laboratorium förbli glesa, och publicerade metoderna kan även presumera tillgång till kromatografi instrumentering som inte är vanligtvis tillgänglig för använda i klassrummet laboratoriet 20. det finns också begränsningar i tillämpningen av IMAC till metalloproteiner, särskilt de som binder redox-känsliga tvåvärda metaller som är väsentliga för verksamheten22. Ofta är den metalliska Jon förlorade eller oxideras under reningen ger ett inaktivt enzym dåligt lämpade för grundutbildning laboratoriet.
En full en tredjedel av enzymer binda en metall Jon23, och trots en nästan universellt krav för järn i alla former av liv23, järn är utan tvekan bland de mest problematiska metalljoner i Enzymologi. Icke-heme Fe2 + bindande enzymer är speciellt benägna att förlust och/eller oxidation av metall under IMAC; förmodligen på grund av avsaknaden av en dedikerad organiska liganden som heme och den lätthet med vilken Fe2 + kan ta avstånd från aminosyran ligander24. Dessutom är syre beroende oxidation av Fe2 + till Fe3 + spontana i vattenlösning, på grund av förändringens negativa fri energi och den relativa stabiliteten i Fe3 +. Ofta, övervinns dessa utmaningar genom användning av anaerob atmosfär och/eller icke-IMAC kromatografiska metoder22. I denna artikel, vi kommer att demonstrera användningen av bänkmonterade IMAC att rena den Fe2 + beroende metalloenzyme L-DOPA dioxygenas med enkla och billiga kromatografi leveranser, följt av beredning av den aktiva platsen Fe2 +, och enzymatisk analys. Dessa metoder är vanliga i vår egen grundutbildning biokemi laboratorium av 6-12 studentgrupper och kan användas för att utöka repertoaren av enzymet utredningar på grundnivå.
Medan tillägg av polyhistidine taggar till rekombinanta proteiner och deras rening av IMAC har blivit praktiskt taget överallt i biokemisk litteratur3,4,5, tillämpningar av IMAC till enzymet rening i biokemi undervisning laboratorium förbli glesa, och publicerade metoder anser inte alltid resource begränsningar av undervisningen laboratorium20. Dessutom är användningen av IMAC i undervisning laboratoriet mest effektiv när kopplat till experiment att bedömer aktivitet och renhet, att göra IMAC rening av ett enzym en idealisk instruktions aktivitet. För att utvidga tillämpningen av IMAC till rening av enzymer, inklusive metalloenzymes, i laboratoriet undervisning behövs tillförlitliga och billiga metoder. I detta protokoll, visar vi bänkmonterade IMAC med lättillgänglig och billig laboratorium leveranser, samtidigt också ta itu med begränsningarna i tillämpningen av IMAC till metalloproteiner22, genom beredning av järn(II) beroende metalloenzyme, L-DOPA dioxygenas, efter rening. Med hjälp av reagenser och material som beskrivs, uppskattar vi kostnaden för förbrukningsmaterial för åtta studentgrupper är mellan $500-600 per termin att köra detta protokoll, inklusive analys stegen som beskrivs i figur 1 och figur 2.
På grund av den lätthet med vilken Fe2 + kan ta avstånd från aminosyran ligander24 och lättköpt oxidation av Fe2 + av O2 till Fe3 +, beredning av icke-heme, är aminosyra kelaterat järn(II) in en rekombinant metalloenzyme en typisk del av enzymet rening. När klassiskt kromatografi används, är det möjligt att undvika total förlust av järn i vissa fall32, men oftare, järn (II) läggs tillbaka i närvaro av reduktionsmedel33,34,35, 36 ofta under en anaerob miljö37,38,39, och i vissa fall överflödigt järn inte är bort33,34,36, komplicerande eventuella efterföljande analys. På varandra följande steg av klassiskt kromatografi och en anaerob miljö är inte realistiska för grundutbildning laboratoriet, föranledde utvecklingen av detta protokoll.
Även manuell beredning av kolumnen Ni-NTA och bearbetning av prover till stor del av tyngdkraften tar extra tid och ansträngning när jämfört med färdigförpackade kolumner och automatiserad jonkromatografi instrumentering, möjliggör manuella steg praktisk inlärning av studenten som resulterar i ökad förståelse av vetenskapen bakom processen. Tillägg av ett järn (II) salt enligt de villkor som beskrivs här är särskilt känslig för överskjutande Ditiotreitol. Om en elev lägger felaktigt till ett överskott av Ditiotreitol, sannolikt en nederbörd händelse. Vi har funnit att det är bra att kräver studenterna att utföra beräkningar av reagens kvantiteter innan de anländer till labbet, så laboratorium tid kan användas mest effektivt på bänken. Hela bänkmonterade IMAC rening – från cell-Lys att protein eluering – kan åstadkommas i en 4-timmars laboratorium period, följt av beredning och analys under en efterföljande lab.
The authors have nothing to disclose.
Denna publikation är baserad på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr CHE 1708237.
consumables | |||
BeadBeater 0.1mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | 1 pound each |
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile | VWR | 21008-178 | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros (Fisher) | AC42420-5000 | |
Sodium Ascorbate | Acros (Fisher) | AC35268-1000 | |
DTT (Dithiothreitol) | Lab Scientific | D-115 | |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigmaaldrich | 310077 | |
HisPur NiNTA Resin | Fisher (pierce) | PI88221 | |
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm | Bio-Rad | 737-1522 | 1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, |
Stopcock Valve, one way, female to male luer | Kimble | 420163-0000 | pack of 50 |
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) | VWR | 301029 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer | Biorad | 7318222 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer | Biorad | 7318225 | |
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) | Bio-Rad | 7318211 | Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling |
Glycerol | Fisher (Pierce) | 17904 | |
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientitic | 23236 | |
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL | VWR | 89000-028 | |
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets | Fisher | 13-676-10F | |
Fiserbrand universal pipet pump | Fisher | 14-955-110 | |
Fisherbrand Transfer Pipets | Fisher | 13-711-9AM | |
Econo-Pac 10DG desalting columns | Bio-Rad | 732-2010 | box of 30 |
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer | Genscript | MB01015 | 5mL (Dilute 1:5 with sample) |
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells | Genscript | M42012 | 20 gels |
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate | Fisher | 14-955-128 | case of 500 |
Cuvette Caps Square Disposable | Fisher | 14-385-999 | |
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) | Acros | D9628-5G | |
Permanent Equipment: | |||
BeadBeater 50mL chamber | BioSpec Products | 110803-50SS | 1 chamber |
BeadBeater | BioSpec Products | 1107900-101 | 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads. |
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL | Fisher | 3119-0050PK | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad | 1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord |
UV-1800 with UV-Probe Software | Shimadzu | UV-1800 | |
Kintek Global Kinetic Explorer | Kintek Corp | version 6 | https://www.kintekexplorer.com/downloads/ |