Nerve Stimulator-guidede injeksjon av Autologous stilk celler i nærheten av Equine venstre nervus recurrens

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å injisere autologous muskel-avledet stilk celler i nærheten til nerven recurrens ved hjelp av en elektrisk nerve stimulator. Denne teknikken kan bli nyttig for behandling av equine tilbakevendende recurrens nevropati.

Abstract

Tilbakevendende recurrens nevropati (RLN) vanligvis påvirker hester og er preget av unormal åndedretts lyder og mosjon intoleranse. Nerven recurrens viser lesjoner av demyelinisering. Fordelen med å bruke stamceller demyelinated nerver har blitt demonstrert i ulike dyr modeller. Målet med undersøkelsen var å teste gjennomførbarhet og sikkerheten til en peri-neuronal injeksjon av autologous muskel-avledet mesenchymal stamceller til den venstre nerven recurrens i friske hester ved hjelp av en elektrisk nerve stimulator.

Muskel-avledet stilk cellen hentes fra fem sunn Standardbred, kvele hester av prøvetaking 20 mg av muskelvev med en halvautomatisk 14 G biopsi nål fra triceps muskelen. Bevegelser av strupehode er overvåket via øvre luftveier video endoskopi. Den venstre nerven recurrens er nærmet seg med en isolert nerve blokk nål. Nervestimulering brukes, start på 2 mA og vellykket bortføringen av den venstre arytenoid overvåkes. Stimulering intensiteten reduseres gradvis. Når et tap av motor svaret er observert på 0,5 mA, 10⁷ autologous muskel-avledet stilk celler er injisert. To sensorer, som er blinde for tidspunktet, score funksjonen recurrens hester før behandling og dag 1 dag 7 og dag 28 etter injeksjon av cellene. I en sjette hest injiseres 1 mL av 2% lidocaine for å ytterligere for å bekrefte riktig posisjonering nålen. Dette fører til en midlertidig lammelse av venstre arytenoid brusk.

Denne studien viser at nerven recurrens kan bli kontaktet med hjelp av en elektrisk nerve stimulator og at elektrisk stimulering av nerve er godt tolerert av hester. Ingen endring av funksjonen recurrens ble observert i noen hester etter injeksjon av stamceller. Videre studier bør utføres for å beskrive effekten av en peri-neuronal injeksjon av autologous muskel-avledet mesenchymal stamceller til hest lider av RLN.

Introduction

RLN er en felles patologi av den øvre luftveier i hester preget av varierende arytenoid lammelse. Venstre side av strupehode påvirkes vanligvis. Utbredelsen av sykdommen kan nå opp til 35% visse hest bestander. Selv om flere hypoteser prøvde å forklare etiologien og patogenesen av denne sykdommen, forblir den eksakte årsaken til RLN usikker. Patologi er beskrevet som en distale axonopathy av nerven recurrens med lesjoner av demyelinisering men også en viss grad av remyelination. Denne axonopathy fører til denervation av iboende recurrens muskler og samtidig atrofi^1,2. Patologi er ofte langsomt progressive og kan føre til et totalt tap av arytenoid bortføring av berørte side³.

Berørte hester avgir unormal åndedretts lyder under trening og noen ganger Vis mosjon intoleranse i mer alvorlige tilfeller. Den definitiv diagnosen er laget av endoscopic eksamen på en ikke-bedøvet stående hest der delvis eller totalt tap av recurrens bortføring er observert^1,2,4. For tiden, er de vanligste behandlingen laryngoplasty (også kjent som “tie-back”), som er noen ganger forbundet med en ventriculo-cordectomy. Selv om total suksessrate på disse surgeries regnes som god til utmerket⁵, er postoperativ komplikasjoner svært vanlig. Den vanligste komplikasjonen er en gradvis tap av bortføring. Barnett et al. ⁶ rapporterte et tap på minst én klasse for bortføring i de seks første ukene etter operasjonen i minst 76% av hester. Andre komplikasjoner, som protesen feil, hoste og luftveier forurensning, er også rapportert⁵.

Stamceller (MSCs) har vært en del av equine medisin i forskning og praksis i mer enn et tiår, selv om bevist studier på deres effektivitet er fortsatt mangelvare. De to mest utnyttet voksne stamceller i hester er benmargen og fettvev⁷. Begge prøvetaking teknikker er relativt invasiv og alltid fører ikke til et tilstrekkelig antall celler. Ceusters et al. nylig ⁷ beskrevet kulturen av stamceller hentet fra striated muskelvev, som oppnås ved en mindre invasiv microbiopsy teknikk.

MSCs er dugelig av selvtillit fornyelse, selv generasjon, multipotency og differensiering^7,8. Deres evne til å skille ut alle mesoderm linjene fra fett, bein, muskler og brusk er nå godt etablert⁹. Men under bestemte forhold, kan de differensieres til ikke-mesenchymal linjene som nerveceller, astrocyttene og myelinating celler av perifere nervesystemet og ryggmargen^9,10. MSCs har allerede blitt brukt i flere nevropati modeller^10,11. Deres evne til å overføre til områder av degenerert nervøs vev og generere neural celler har vist etter en systemisk og lokal administrasjon¹¹. Videre kan Schwann-lignende cellene stammer fra MSCs rekruttere makrofager for å fjerne mobilnettet rusk og skiller nevrotropisk faktorer fremme axonal vekst og remyelination⁹.

Målet med denne studien er å beskrive teknikken for en nerve stimulator-guidede injeksjon av muskel-avledet autologous stilk celler i den venstre nerven i friske hester recurrens. Vanligvis brukes en nerve stimulator koblet til en injeksjon nål electro-lokalisering av eksterne nerver vil bruke lokale anesthetics på at området¹². En svak likestrøm impuls leveres i nærhet til nerve til å indusere motor svar. Muligheten til å produsere dette motor svaret avhenger av flere parametere som ledende området nålen, noen impedans på vevet, gjeldende brukes, puls varigheten og avstanden fra nålen til nerve. Nerve stimulator nåler er utformet for å ha et svært restriktive ledende område på spissen av nålen, mens resten av nålen er isolert. Denne hjelper for å lokalisere nettopp nerve. Moderne nervestimulatorer tilpasse til ulike vev impedances og leverer konstant strømstyrken på maskinen. Videre de fleste maskiner bruke puls varighet 0,1 s, slik at determinative parametrene er gjeldende brukt og avstand til nålen. Forholdet mellom p-til-nerve avstand og gjeldende nødvendig for å produsere en motor respons er beskrevet av Coulombs lov: E = kQ/r; hvor E er nødvendig stimulering kostnader, k er Coulombs konstant, Q er minimal nødvendig stimulering kostnader og r er avstanden mellom de to elektrodene. I elektro-lokalisering av nerver som avstanden mellom de to elektrodene skal p til nerve avstand¹². Elektrisk ladning forsvinner etter regelen av inverse kvadratet av p-til-nerve avstand¹³. Klinisk praksis har vist at motoren nerve stimulering på 0,5 mA er sterkt korrelert til den vellykkede nerve og at tap av motor signal på lavere strøm vil forhindre brukeren administrere utilsiktet intraneuronal injeksjoner. Målet med denne studien er å teste gjennomførbarhet og sikkerheten til denne teknikken i et begrenset antall hester. Hvis av gjennomførbarhet og sikkerheten til denne teknikken er bekreftet, kan enkelt overføres til berørte hester. Videre, equine RLN kan tjene som en modell for perifere degenerative neuropathy.

Protocol

Kommisjonen for etisk bruk av dyr på Universitetet i Liege godkjent av studie-protokollen. 1. muskel Microbiopsy Identifisere webområdet utvalg av visuell inspeksjon og palpasjon, i det lange hodet i triceps muskler, ca midtlinjen mellom punktet av albuen og poenget med skulderen. Klipp en sone av ca 2 x 2 cm2 med en elektrisk avklipt. Bruke kirurgisk scrub bestående av polyiodide flytende såpe og alkohol komprimerer for 1 min over det beskårede området. Injiser subcutaneously 1 mL av 2% lidocaine løsning med en 25 G nål i midten av sonen kuttet og desinfiseres. Skrubbe hender med antibakterielle håndsåpe. Sette på sterilt hansker. Bruke en engangs sterilt drapere som en steril overflate plassere biopsi nålen og trocar på. Armen halvautomatisk 14 G biopsi nålen ved å trekke våren mekanismen som vist i tall 1b og 1 c. Slipp biopsi nålen å bli kjent med dens mekanikk. Plassere væpnede biopsi nålen på sterilt. Bli kjent med trocar, som består av en kanyle og en obturator som vist i figur 1en. Figur 1 : Hvilke biopsi nål. Biopsi nål settet består av (en) kanyle og dens obturator og biopsy p (fra topp til bunn). Andre kategorier viser biopsi nålen i sin (b) nøytral og (c) bevæpnet posisjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Forbered trocar ved montering av kanyle og obturator og holde dem i låst posisjon. Introdusere trocar vinkelrett på huden gjennom tidligere ufølsomme sonen. Videre på trocar til en stilling der spissen av trocar er ca 1,5 cm dyp i muskelen. Ta trocar ut distansere kanyle fra sin obturator og plassere obturator på sterilt. Introdusere væpnede biopsi nålen gjennom kanyle. Introdusere nålen og kanyle gjennom huden snitt inn i muskelen. Advance nålen til en stilling der spissen av nålen er midt i det lange hodet i triceps muskelen. Slipp biopsi nålen og trekk ut biopsi nålen sammen med kanyle. Dra biopsi pinnen av kanyle. La kanyle på sterilt overflaten. Åpne biopsi nålen ved å trekke våren med én hånd og holde den med andre.Merk: Prøven blir synlig på spissen av biopsi nålen. Med hjelp av en annen person, åpne eksempel røret som inneholder eksempel medium. Bruk en 19 G sprøyte nål for å fjern liten muskel på biopsi p. Plass muskel prøven i prøvetaking medium. Lukk røret med skrukork og forsiktig vippe den 2 x slik at prøven flyter i medium. Armen biopsi nålen. Ta kanyle fra sterilt overflaten og Monter den væpnede biopsi nål og kanyle. Introdusere væpnede nålen og kanyle gjennom huden snitt som beskrevet tidligere. Gjenta eksempel 2-3 x til ca 20 mg av muskelvev samples. Lukk prøvetaking røret. Forsiktig slå røret 2 x å blande muskel bitene med prøvetaking medium. Skipet prøvene til laboratoriet ved en konstant temperatur mellom 4 til 8 ° C.Merk: Laboratoriet vil deretter behandle prøven. Protokollen kan pauses her. Prosedyren er godt tolerert og sårhet på prøvetaking side er ikke observert. I det usannsynlige tilfellet av stølhet observert på webområdet prøvetaking, administrere riktig smertestillende behandling. 2. behandling av cellene Merk: Stamceller brukt i denne studien er utarbeidet i henhold til metoden beskrevet av Ceusters et al. 7. deres artikkelen beskriver også karakterisering av cellene. Start ved å forberede den bestemte kultur mediet, DF20, ved å legge til 20% av inaktivert fosterets bovin serum, 5 mL av penicillin (1000 IU/mL)-streptomycin (10.000 µg/mL) og 2,5 mL av amfotericin B (250 µg/mL) en flaske 500 mL en kommersielt tilgjengelig kultur medium med glutamin og fenol rød. Hell 150 µL av DF20 kultur medium i hver av indre 16 av en 24-multi-godt rett. Hell 1 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) [kalium klorid (200 mg/L), kalium fosfat monophasic (200 mg/L), natriumklorid (8000 mg/L) og kalium fosfat diphasic (2,160 mg/L)] i de gjenværende ytre brønnene. Skyll den lille muskelen biter 2 x i PBS. Skille dem i veldig små biter med hjelp av en skalpell og tang og Legg en liten bit (av størrelsen på spissen av skalpell bladet) i hver indre-16 godt av flere godt parabolen. Plasser flere godt rett i en inkubator opprettholdt på følgende: 37 ° C, 21% O2og 5% CO2. Overvåke brønnene hver dag under en invertert mikroskop og legge til 50 µL av DF20 hvis det er nødvendig for å hindre cellene tørker ut.Merk: Etter ca 10 d, vil det være nok celler vokst fra explant å tillate stamcelleforskningen isolasjon. Protokollen kan pauses her. Når en glorie av celler vises rundt muskel explants, forkaste explant av muskelvev. Koble celler ved hjelp av 150 µL av en EDTA inneholder trypsin løsning i hver brønn: forkaste kultur medium, skyll cellene med 1 mL av PBS, forkaste PBS og legge til trypsin løsningen for maksimalt 10 min på 37 ° C. Legge til kultur medium for å stoppe handlingen av trypsin, høste celle suspensjon, og deretter virvel celle suspensjon 200 x g i 10 min på 37 ° C. Forkast nedbryting og avbryte pellet en balansert salt løsning. Overfør celle suspensjon for en usammenhengende tetthet gradient 3 lag (15%, 25% og 35%). Sentrifuge røret som inneholder cellen suspensjon og usammenhengende tetthet gradert løsning på 1250 x g for 20 min på 25 ° C. Ikke bruk bremsen av en sentrifuge. Observere celle fraksjoner med forskjellige tettheter som vises mellom de forskjellige lag av usammenhengende tetthet gradert løsning etter sentrifugering. Fortsette kulturen med brøken mellom 15 og 25%. Overføre den til en rør og vask det med balansert salt løsning. Sentrifuge celle suspensjon på 200 x g i 10 min på 37 ° C. Kast nedbryting. Fortsett med suspendere pellet i 1 mL av DF20. Prefill en celle kultur kolbe, med en overflate av 25 cm2, med 6 mL av DF20. Overføre cellene i forhåndsutfylte celle kultur flasken og kultur dem i en inkubator med følgende vilkår: 37° C, 21% O2og 5% CO2.Merk: Protokollen kan pauses her. Overvåke cellene hver dag under en invertert mikroskop. Endre kultur medium om nødvendig (forkaste gamle mediet og legge 6 mL av ny kultur medium). Bestemme mobilnettet samløpet ved å observere celle lagene i kultur retter, med en optisk mikroskopet på en forhåndsdefinert forstørrelse. Beregne overflaten av fatet som er opptatt av cellene. Arbeid på en fast mikroskopiske forstørrelse for hver observasjon å kunne evaluere samløpet. Når cellene opptar 85% av overflaten av retten, fortsette med en passasje av cellene. Når cellene er confluent, koble dem med en EDTA inneholder trypsin løsning med samme protokoll som beskrevet i trinn 2.4. Deretter sentrifuge celle suspensjon på 200 x g i 10 min på 37 ° C. Forkaste nedbryting og fortsett med rørets cellene i 5 mL av DF20. Plass dem i en celle kultur kolbe 175 cm2 forhåndsutfylt med 25 mL av DF20. Plasser flasken i en inkubator med følgende vilkår: 37° C, 21% O2og 5% CO2.Merk: Protokollen kan pauses her. Overvåke cellene hver dag under en invertert mikroskop. Om nødvendig endre medium (forkaste gamle mediet og legge 30 mL av nytt medium). Når cellene er confluent, koble dem med trypsin-EDTA som beskrevet i trinn 2.4. Deretter sentrifuge celle suspensjon på 200 x g i 10 min på 37 ° C. Forkast nedbryting og suspendere cellene i 6 mL av DF20. Sted 1 mL av cellen suspensjon i seks 175 cm2 flasker, hver forhåndsutfylt med 25 mL av DF20, og kultur dem på 37 ° C i en CO2 inkubator (med 21% O2 og 5% CO2). Overvåke cellene hver dag under en invertert mikroskop. Om nødvendig endre medium (forkaste gamle mediet og legge til 30 mL av nytt medium i hver kolbe). Når cellene er confluent, koble dem med trypsin-EDTA som beskrevet i trinn 2.5. Sentrifuge dem 3 x 200 x g i 10 min på 37 ° C og Forkast nedbryting på hvert trinn. Telle celler ved hjelp av en Bürker telling kammer og lys mikroskop. Forberede en mobilnettet suspensjon av 10 millioner celler/mL av en bestemt kryonisk bevaring medium. Deep-Freeze terapeutiske doser med 1 x 107 celler i 1 mL av kryonisk bevaring medium og lagre dem i damp fase av flytende nitrogen til deres bruk.Merk: Protokollen kan pauses her. Skipet cellene i ampullen på tørris for endelig bruk. 3. injeksjon av cellene Merk: To personer må utføre injeksjon av stamceller. Varm celle suspensjon gradvis til romtemperatur. Sug opp suspensjon i en 2 mL sprøyte. Sedate hesten ved å injisere detomidine 10 µg/kg i vena jugularis med en 19 G sprøyte nål. Vent 5 min å se effekten av sedasjon, som blir synlig av karakteristiske hodet ned plasseringen til hesten. Klipp en sone av 20 x 10 cm2 over venstre recurrens regionen hest med en clipper, som vist i figur 2. Bruk deretter en kirurgisk finpuss av polyiodide såpe og alkohol til det beskårede området. Plasser en fleksibel standard video endoskop gjennom det venstre neseboret av hesten og gå videre mot nasopharynx. Juster plasseringen av endoskop til en full oversikt over både arytenoid brusk og at epiglottis er oppnådd. Hold endoskop i denne posisjonen under prosedyren og slå skjermen av det video endoskop mot operatørene. Koble stimulering/injeksjon nålen til nerve stimulator negative elektroden. Opprettholde de sterile forholdene nålen. Koble den positive elektroden av nerve stimulator til en elektrode patch, som er fast til området kuttet huden. Koble sprøyten som inneholder cellen suspensjon til injeksjon linje og prefill røret å jage luften av systemet. Husk volumet av systemet og forberede en sprøyte med samme volum av sterilt saltvann. Hvis ikke kjent med denne teknikken, kan du bruke en desinfiseres 5 til 7 MHz lineær ultralyd svinger for å visualisere anatomiske strukturer i regionen rundt. Bruk en steril ultralyd kopling gel for å øke bildekvaliteten. Visualisere strupehode og fartøyene som kjører i regionen dorsal i strupehodet. Når kjennskap til anatomi av regionen, introdusere stimulering/injeksjon nålen mot dorsolateral aspekt av strupehodet. Når du nærmer deg det dorsolateral aspektet av strupehode, starte nerve stimulator i 1 Hz stimulering modus med en strøm av 2 mA. Forsiktig flytte nålen mot plasseringen av nerven recurrens mens observere endoskopisk visningen på skjermen. Så snart bortføring bevegelsen av venstre arytenoid brusk er synlig på skjermen, redusere gjeldende til bevegelsen forsvinner samtidig nålen på plass. Identifisere den ideelle plasseringen av nålen. Vurdere tap av motor svar på 0,5 mA som ideelle avstanden fra nerve. Når arytenoid brusk bevegelser vedvarer på strøm lavere enn 0.4 mA, ikke injisere cellene, som som kan resultere i en intraneuronal injeksjon. Når tapet av motor svar på 0,5 mA er observert, injisere celle suspensjon som inneholder 107 autologous stilk celler og skyll injeksjon linjen med saltvann forberedt trinn i 3.6. Dette vil sette inn resten av cellen suspensjon som forble i injeksjon røret. Etter injeksjon av cellene, ta ut nålen og endoskop. La hesten gjenopprette fra beroligende. Ingen ytterligere behandling er nødvendig for webområdet biopsi.

Representative Results

Kommisjonen for etisk bruk av dyr på Universitetet i Liege godkjent av studie-protokollen. Seks hester fra flokken av forskning hester på Mont-le-Soie Equine senteret ble inkludert i denne studien. I den første hesten, var nerven recurrens lokalisert ved elektrosimuering. Figur 2 viser innstillingen, med stimulering nålen settes inn i den venstre dorsolateral aspekten av strupehode av hesten i nerve stimulator. Når tapet av arytenoid brusken er observert på 0,5 mA, 1 mL av 2% lidocaine injiseres. Dette resulterte i et fravær av bevegelse ved høyere strømmer og en midlertidig lammelse av den venstre arytenoid. Kontroll endoscopy, 24 timer senere, viste en fullstendig gjenoppretting av funksjonen arytenoid. Hele protokollen ble ble gjentatt i fem hester. Ingen hester viste en negativ reaksjon på muskel microbiopsy. I alle hester, ble et tilstrekkelig antall celler dyrket i den fastsatte tid. Den øvre luftveier endoscopy ble utført i alle fem hester og recurrens funksjonen score jeg eller II.1 ifølge Robinson et al. 14 ble bestemt. Alle hestene tolerert nervestimulering av nerven recurrens godt. Ingen negativ reaksjon ble observert under eller etter stimulering eller injeksjon av stamceller. Alle endoscopies ble registrert og scoret to blendet klinikere. Det var ingen forskjell mellom pre injeksjon scorene til funksjonene recurrens og score oppnådd på dag 1, 7 og 28 etter stamcelleforskningen injeksjon, som testet av Diversified rank analyse15. Tabell 1 oppsummerer recurrens scorene til alle hestene på forskjellige tidspunkt, samt tiden fra innsetting av nålen til injeksjon av stamceller og gjeldende som provoserte den arytenoid bevegelsen når cellene der injisert. Cellene som er brukt i studien ble utarbeidet i henhold til en protokoll publisert tidligere7. Cellene fra alle fraksjoner kunne trilineage differensiering, CD90 og CD44, uttrykker ikke CD45 og MHC-II og hadde clonogenic kapasiteter. Cellene i 15-25% brøken har blitt valgt for videre behandling fordi de viste den største uttrykket for CD90 og de største proliferativ kapasitetene. Målet med denne studien var ikke å teste effektiviteten av stilk cellen programmet generere en skadet perifere nerve men bare for å teste muligheten for prosedyren og vurdere sikkerheten av stamceller injeksjon til nerven recurrens i en smal l antall sunt hester. Fravær av noen funksjonelle endringer på endoskopisk bildebehandling i fem hester opp til 28 dager etter injeksjon og fravær av kliniske tegn i fire av de fem hester opp til 1 år etter injeksjon bekrefter muligheten og sikkerheten til prosedyren. En hest fikk å bli euthanized i oppfølging periode for anledninger ikke relatert å studere. Selv om teknikker vise seg for å være trygg i en rekke hester, er antall hester inkludert studien for lavt til å vise fravær av sjeldne hendelser. Resultat før injeksjon Tid for injeksjon (min) Gjeldende på injeksjon (mA) Score på dag 1 innlegg injeksjon Score på dag 7 innlegg injeksjon Score på dag 28 legge injeksjon Hest 1 (Standardbred, kvele, mare, 16 år) II.1 12 0,5 Jeg II.1 II.1 Hest 2 (Standardbred, kvele, mare, 22 år gammel) Jeg 3 0,7 Jeg Jeg Jeg Hest 3 (Standardbred, kvele, mare, 11 år gammel) II.1 4 0,5 II.2 II.1 II.1 Hest 4 (Standardbred, kvele, mare, 12 år gammel) Jeg 7 0,5 Jeg II.1 Jeg Hest 5 (Standardbred, kvele, mare, 10 år) Jeg 3 0,7 II.1 Jeg Tabell 1: Signalment og strupe fungere score av hestene. Denne tabellen viser tidspunktet for injeksjon, laveste gjeldende provoserte noen arytenoid bevegelsen før injeksjon, og recurrens score av fem sunn hester før og på dag 1, 7 og 28 etter injeksjon av autologous muskel-avledet mesenchymal stamceller i nærhet til den venstre tilbakevendende nerven recurrens. Hest #5 var ikke tilgjengelig for kontrollen på dag 28 etter injeksjon grunner ikke er relatert til denne studien. Poengene se poengene beskrevet av Robinson et al. 14. her score jeg betyr at bevegelsene til både arytenoid cartilages var synkrone og symmetrisk, og en komplett bortføring av begge arytenoid cartilages kunne oppnådd og opprettholdt. Poengsummen II.1 betyr at bevegelsene til arytenoid cartilages var asynkrone eller kan være asymmetrisk enkelte ganger; men kunne en komplett bortføring av begge arytenoid cartilages oppnådd og opprettholdt. Figur 2 : Angir under injeksjon av stamceller. Nerve stimulering nålen er introdusert på venstre side i strupehodet og rettet mot den venstre nerven recurrens. Nerve stimulator ligger på 0,8 mA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver bruk av muskel-avledet autologous stilk celler på tilbakevendende recurrens nervene i hester med en nerve stimulator-guidet tilnærming. Innhøstingen av muskel microbiopsy prøven, samt isolasjon, kultur og karakterisering av stamceller, har blitt beskrevet i detalj før, mens injeksjon av disse cellene i nærhet til en ekstern nerve er original. Electro-lokalisering av nerve med en elektrisk nerve stimulator har tjent i studien og ble brukt til å injisere stamceller i nærheten av nervus recurrens. Motor svaret ble overvåket av video endoskopi gjennom nasopharynx. Hvis, under plassering av nålen, andre nerver ble stimulert, var tilsvarende bevegelsen synlig på skjermbildet endoskopi. En vellykket stimulering av nerven recurrens ble preget av typiske bortføringen av arytenoid brusk. I en hest, ble lokal bedøvelse injisert for å indusere en midlertidig lammelse av arytenoid muskelen. Selv om den vellykkede implantasjon cellene i nærhet til nerve ikke er testet i denne studien, viste elektro-lokalisering av nerve og injeksjon på en lav strøm at stamceller ble brukt i nerve. I injectate nærhet til nerve ble ytterligere demonstrert av en vellykket motor blokk indusert av en injeksjon av en lokal bedøvelse.

I de resterende fem hestene, tiden fra første stimulering til vellykket stamcelleforskningen injeksjon varierte fra 3 til 12 min. hester var litt bedøvet under prosedyren, som økte deres samsvar med elektrisk stimulering. Ingen hester viste bivirkninger når som helst indikerer at varigheten av stimulering kan bli forlenget hvis nødvendig for å oppnå god nål posisjonering. En bratt læringskurve forventes å bli observert hvis operatøren bruker denne teknikken regelmessig og i flere hester med varierende anatomi.

Hester vanligvis lider av RLN, som er preget av varierende grad av lammelse av venstre arytenoid brusken fører til unormal åndedretts lyder og mosjon intoleranse. En histology av berørte nerver avslører typisk lesjoner Perifer nevropati¹⁶. Perifer nevropati er brukt for å beskrive ulike typer eksterne nerve lesjoner fører til svekket opplevelser, bevegelser eller orgel funksjoner. Årsakene er svært variabel og kan inkludere diabetes, næringssalter mangler, behandling med spesifikke medikamenter, en traumatisk skade, iskemi eller en infeksjon, eller de kan være spontan. Uavhengig av årsaken, eksterne neuropathies dele felles histopathological tegn, som Wallerian degenerasjon, distale axonopathy eller Segmentinformasjon demyelinisering. Det har vist at administrasjonen av mesenchymal stamceller skadet perifere nervene kan være fordelaktig for deres regenerering; men er de underliggende mekanismene ikke godt forstått. Tradisjonelt, tror vi at stamceller vil bare skille ut progenitors av liggende under adipose, muskler, brusk og bein vev, men under bestemte forhold de har vist å differensiere i myocytter¹⁷, astrocyttene¹⁸ , og myelinating celler av eksterne¹⁹ og sentralnervesystemet¹⁹. Under en i vitro kultur prioriteres en eksponering mot neuropeptides differensiering av mesenchymal stamceller i celler som uttrykker neuronal markører^21,22. Flere i vivo studier har vist gunstige effekten av mesenchymal stamceller nerven fornyelse og en funksjonelle utvinning i rotte modeller av ischias nerven skade^10,23. Dette er sannsynligvis forårsaket av gunstige miljømessige forhold som bidrar til differensiering av stamceller i vev-spesifikke celler²⁴. Fremtidige studier bør også undersøke denne teknikken for administrasjonen av pre differensierte celler i RLN-berørte hester.

Best av vår kunnskap er dette den første rapporten som beskriver bruken av en nerve stimulator å lokalisere en ekstern nerve for å injisere en behandling i den. Andre eksterne nerve patologi i ulike arter, som nevropatisk smerte, kan behandles av administrasjonen av stamceller i nærhet til nerve^25,26. Fremtidige studier bør teste effekten av denne teknikken i klinisk pasienter og undersøke risikoen for overføring og potensialet av injisert cellene.

Materials

Detomidine (Domidine)	Dechra		sold through pharmacy
Lidocaine (Xylocaine)	Movianto		sold through pharmacy
TOF Watch S (Nerve stimulator)	Alsevia	79950161
TSK Starcut (Biopsy needle)	STSK laboratory	SAG – 14090C
Electrostimulation needle	Pajunk	001185-79
DMEM – F12 (culture medium)	Lonza	LO BE12-719F
Heat inactivated FBS	Life technologies	10500
Penicillin-streptomycin	Lonza	DE17-602E
Amphotericin B (Fungizone)	Lonza	17-836E
Phospate buffered saline	Lonza	LO BE17-512F
24-multiwell dish	Corning	3524
Trypsin	Life technologies	12604
HBSS	Lonza	LO BE10-508F
Percoll PLUS	GE Healthcare	17544502
NaCl	Sigma	S8776
T-25cm² flasks	Nunclon	136196
T-175 cm² flasks	Nunclon	178883
Cryostore CS5	Biolife solutions	205373