Storstilet tredimensional billeddannelse af cellulære organisation i mus Neocortex
Summary
Her beskriver vi en procedure for væv clearing, fluorescerende mærkning og storstilet billeddannelse af musen hjernevæv, som dermed giver mulighed for visualisering af den tredimensionale organisation af celletyper i neocortex.
Abstract
Pattedyr neocortex er sammensat af mange typer af excitatoriske og hæmmende neuroner, hver med specifikke elektrofysiologiske og biokemiske egenskaber, synaptiske forbindelser, og i vivo fungerer, men deres grundlæggende anatomiske og funktionelle organisation fra cellular netværk målestok er dårligt forstået. Her beskriver vi en metode for den tre-dimensionelle billeddannelse af fluorescently mærket neuroner på tværs af store områder af hjernen for undersøgelsen af de kortikale cellulære organisation. Specifikke typer for neuroner er mærket af injektion af fluorescerende retrograd neuronal røbestoffer eller udtryk for fluorescerende proteiner i Transgene mus. Blok hjernen prøver, f.eks. en halvkugle, er udarbejdet efter fiksering, lavet gennemsigtig med væv clearing metoder og underkastes fluorescerende immunolabeling af de specifikke celletyper. Store områder er scannet ved hjælp af Konfokal eller to-foton mikroskoper udstyret med store arbejde afstand mål og motoriseret faser. Denne metode kan løse den periodiske organisation af celle typespecifikke microcolumn funktionelle moduler i mus neocortex. Proceduren kan være nyttig for studiet af tre-dimensionelle cellulære arkitektur i de forskellige hjerne områder og andre komplekse væv.
Introduction
Pattedyr neocortex er sammensat af en lang række celletyper, hver med bestemte gen expression mønstre, elektrofysiologiske og biokemiske egenskaber, synaptiske forbindelser, og i vivo funktioner1,2 ,3,4,5,6,7. Hvorvidt disse celletyper er organiseret i gentagne strukturer har været uklare. Kortikale kolonner, herunder visuel orientering kolonner og somatosensoriske Tønder, har gentaget strukturer, men deres cellulære organisation forbliver uklart8,9. Disse er til stede i de specifikke kortikale områder og er ikke en hjerne-dækkende system.
I neocortical lag 5, er det store flertal af neuroner klassificeret i fire hovedtyper. En større type af excitatoriske neuroner, sub cerebral projektion neuroner, projekter axoner til subkortikale mål herunder pons, rygmarven og overlegen colliculus og derfor repræsenterer store kortikale output vej10. Cortical fremskrivning neuroner, en anden store type excitatoriske neuroner, innerverer cortex10. Hæmmende neuroner også indeholder to store klasser: parvalbumin-udtrykker og somatostatin-udtrykke celler11.
De seneste analyser viser, at de fire celletyper er organiseret i gentagne strukturer12,13,14. Både sub cerebral projektion neuroner12,13,14 og cortical fremskrivning neuroner14 organisere i celletype specifikke microcolumns med en diameter på 1-2 celler. Parvalbumin-udtryk og somatostatin-udtrykke celler Juster specifikt med microcolumns af sub cerebral projektion neuroner, men ikke med microcolumns af cortical fremskrivning neuroner14. Microcolumns sig justere med jævne mellemrum til at danne en sekskantet gittermaster array14 og er til stede i flere kortikale områder herunder visuel, somatosensoriske og motoriske områder i mus hjernen12,14 og sprog områder af menneskets hjerne13. Neuroner i den enkelte microcolumn udviser synkroniseret aktivitet og har lignende sensoriske svar14. Disse observationer viser at lag 5 celletyper organisere i et microcolumn gitterstruktur der repræsenterer den første kendte hjerne-dækkende organisation for at gentage funktionelle moduler.
Microcolumns har en radius på ca. 10 µm og har en rumlig hyppighed af ca 40 µm. Derudover er orienteringen af microcolumns parallel til deres apikale dendritter og skifter, afhængigt af deres placering i cortex14. Microcolumn systemet er derfor vanskeligt at analysere ved hjælp af konventionelle kortikale skiver med en typisk tykkelse på et par snese mikrometer. Derudover analyse af periodicitet kræver tre-dimensionelle data fra en bred vifte af områder i hjernen, og derfor typisk imaging området Konfokal mikroskopi eller i vivo 2-foton imaging er for snæver.
For nylig, teknikker er blevet udviklet for at fjerne tykt væv15,16. Her beskriver vi anvendelsen af disse metoder til at opnå store, tre-dimensionelle billeder af de store celletyper i mus neocortical lag 5, der udgør microcolumn systemet. Subcerebral projektion neuroner er mærket af retrograd mærkningsbestemmelserne eller udtryk for den forbedrede grøn fluorescerende protein i Crym-egfp Transgene mus12og cortical fremskrivning neuroner er mærket af enten den retrograd mærkning eller af tdTomato udtrykket i Tlx3–cre/Ai9 mus17. Parvalbumin-udtryk og somatostatin-udtrykke celler er mærket af Immunhistokemi. (Antistof skala S) AbScale metode18 bruges til antistof farvning eksperimenter, mens (Se Deep Brain) SeeDB metode19 bruges til andre eksperimenter. Disse metoder overvinde de ovennævnte vanskeligheder af de konventionelle Billeddannende metoder og afsløre den nøjagtige cellulære organisation af lag 514.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har udarbejdet procedurer for at opnå store tre-dimensionelle billeder af celle type-specifikke organisation af de store celletyper i mus neocortical lag 5. Sammenlignet med konventionelle skive farvning, er metoden mere nyttigt i fastlæggelse af den tredimensionale organisation af neocortex. Metoden gør det billede erhvervelse fra den bredere og dybere hjernen regionerne i forhold til typiske i vivo 2-foton mikroskopi eller konventionelle Konfokal mikroskopi og således kan tillade, at den omfattende anal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Atsushi Miyawaki og Hiroshi Hama for deres råd om AbScale eksperimenter, Charles Yokoyama til redigering af manuskriptet, Eriko Ohshima og Miyuki Kishino for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra RIKEN T.H. og Grants-in-Aid for videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT) af Japan til T.H. (Innovative områder “Mesoskopisk Neurocircuitry”, 22115004) og S.S. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be?. Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
