Storskaliga tredimensionell avbildning av cellulära organisation i mus hjärnbarken
Summary
Här beskriver vi ett förfarande för vävnad clearing, fluorescerande märkning och storskaliga avbildning av mus hjärnvävnad som därmed möjliggör visualisering av tredimensionella organisationen av celltyper i hjärnbarken.
Abstract
Däggdjur hjärnbarken består av många typer av retande och hämmande nervceller, alla med specifika elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper, synapsförbindelser, och i vivo fungerar, men deras grundläggande funktionell och anatomisk organisation från cellulära nätverk skala är dåligt känd. Här beskriver vi en metod för den tredimensionell avbildning av fluorescently-märkta nervceller över stora områden av hjärnan för utredning av kortikala cellulära organisationen. Vissa typer av nervceller är märkta av injektion av fluorescerande retrograd neuronala spårämnen eller uttryck av fluorescerande proteiner i transgena möss. Blockera hjärnan prover, t.ex. ett halvklot, är berett efter fixering, gjorts genomskinligt med vävnad clearing metoder och utsätts för fluorescerande immunolabeling de specifika celltyper. Stora områden är genomsökt med confocal eller två-foton Mikroskop utrustade med stora arbeta avstånd mål och motoriserade stadier. Denna metod kan lösa den periodiska organisationen av cell typspecifika microcolumn funktionella moduler i mus neocortex. Förfarandet kan vara användbar för studien av tredimensionella cellulära arkitekturen i de olika hjärnområden och andra komplexa vävnader.
Introduction
Däggdjur hjärnbarken består av ett stort antal celltyper, alla med en specifik gen uttrycksmönster, elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper, synapsförbindelser, och i vivo fungerar1,2 ,3,4,5,6,7. Huruvida dessa celltyper är organiserade i upprepade strukturer har varit oklart. Kortikala kolumner, inklusive visuell orientering kolumner och somatosensoriska fat, har upprepat strukturer, men deras cellulära organisation förblir oklart8,9. Dessa finns i de specifika kortikala områdena och är inte en hjärna-omfattande system.
I hjärnbarkens lager 5 indelas den stora majoriteten av nervceller i fyra huvudtyper. En viktig typ av excitatoriska nervceller, sub cerebral projektion nervceller, projekt axoner subkortikala mål inklusive pons, ryggmärgen och superior colliculus, och därför representerar de största kortikala utgång väg10. Kortikala projektion nervceller, en annan huvudtyp av excitatoriska nervceller, innerverar de cortex10. Hämmande nervceller innehåller också två stora klasser: parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler11.
Senaste analyser visar att de fyra celltyper är organiserade i upprepade strukturer12,13,14. Både sub cerebral projektion nervceller12,13,14 och kortikala projektion nervceller14 organisera celltyp specifika microcolumns med en diameter på 1 – 2 celler. Parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler justera specifikt med microcolumns av sub cerebral projektion nervceller men inte med microcolumns av kortikala projektion nervceller14. Microcolumns själva anpassa regelbundet till form en sexkantig galler array14 och finns i flera kortikala områden inklusive visuell, somatosensoriska och motoriska områden mus hjärnan12,14 och språk områden av den mänskliga hjärnan13. Nervceller i de enskilda microcolumn uppvisar synkroniserade aktivitet och har liknande sensoriska Svaren14. Dessa observationer tyder på att lager 5 celltyper organisera en microcolumn gitterstrukturen som representerar den första kända hjärna-wide organisationen av upprepande funktionella moduler.
Microcolumns har en radie på ca 10 µm och en rumslig periodicitet av ungefärligt 40 µm. Orientering på microcolumns är dessutom parallellt med sin apikala dendriter och förändringar beroende på deras position i cortex14. Det microcolumn systemet är därför svåra att analysera med hjälp av konventionella kortikala skivor med en typisk tjocklek av några tiotals mikrometrar. Dessutom analysen av periodicitet kräver tredimensionella data från en lång rad områden i hjärnan, och, därför, konfokalmikroskopi typiska imaging området eller i vivo 2-photon imaging är för smal.
Nyligen har det utvecklats metoder för att rensa tjocka vävnader15,16. Här beskriver vi tillämpningen av dessa metoder att få storskaliga, tredimensionella bilder av de stora celltyper i mus hjärnbarkens lager 5 som utgör det microcolumn systemet. Subcerebral projektion nervceller är märkta av den bakåtsträvande märkning eller uttryck för förbättrad grönt fluorescerande protein i Crym-andra transgena möss12– och kortikal projektion nervceller är märkta av antingen den retrograd märkning eller i tdTomato uttrycket i Tlx3–cre/Ai9 möss17. Parvalbumin-uttryckande och somatostatin-uttryckande celler är märkta av immunohistokemi. (Antikropp skala S) AbScale metod18 används för antikroppen färgning experiment, medan (se Deep Brain) SeeDB metod19 används för andra experiment. Dessa metoder ovan nämnda svårigheterna av de konventionella avbildningsmetoder och avslöja den korrekta cellulära organisationen lager 514.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har lagt fram förfaranden för att erhålla storskaliga tredimensionella bilder av cell typspecifika organisationen av de stora celltyper i mus hjärnbarkens lager 5. Jämfört med konventionella slice färgningen, är metoden mer användbar för att fastställa den tredimensionella organisationen av hjärnbarken. Metoden möjliggör bild förvärv från den bredare och djupare hjärnan regionerna jämfört med typiska i vivo 2-foton mikroskopi eller konventionella konfokalmikroskopi och, därmed, kan tillå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Atsushi Miyawaki och Hiroshi Hama för deras råd om AbScale experimenten, Charles Yokoyama för redigering av manuskriptet, Eriko Ohshima och Miyuki Kishino för deras tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av forskningsmedel från RIKEN att T.H. och Grants-in-Aid för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT) av Japan att T.H. (innovativa områden ”Mesoskopisk Neurocircuitry”; 22115004) och S.S. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
References
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462 (2015).
- Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
- Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be?. Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
- Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
- Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
- Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
- Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
- Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kim, S. -. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
