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Developmental Biology

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

Abstract

시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간의 뇌 연구 관련 모델의 부족 이다. 이 문제를 해결 하려면 한 신흥 기술을 3 차원 (3D) 신경 세포 배양, ‘organoids’ 또는 ‘spheroids’, extracellular 접착 분자를 포함 하 여 세포 상호 작용의 장기 보존에 대 한 나의 사용 이다. 그러나, 이러한 문화 시스템은 시간 소모 하 고 체계적으로 생성 된. 여기, 우리 신속 하 고 지속적으로 신경의 3D cocultures을 생산 하는 방법에 자세히 설명 하 고 인간 만능에서 이다 줄기 세포. 첫째, 미리 차별화 이다 신경 창시자는 해리와 계산. 다음으로, 셀 영역을 형성 결합 되어 요리로 키 니 아 제 억제제와 재현 크기의 구체를 생산 하는 특정 비율에. 몇 주 후 문화의 부동 구체로, cocultures (‘소행성’) 마지막으로 immunostaining에 대 한 구분 또는 시 냅 스 밀도 강도 측정 하는 multielectrode 배열에 따라 도금. 일반적으로,이 프로토콜 표시 성숙한 세포 유형 제한 표식, 기능 시 냅 스를 형성 하 고는 자발적 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 전시 3D 신경 분야를 얻을 것입니다 예상 된다. 함께,이 시스템 단층 문화에 비해 더 적합 한 모델에서 약물 검사와 질병의 메커니즘에 대 한 조사를 허용 합니다.

Introduction

이다는 구조 지원 이상 기능적인 책임의 다양 한 중앙 신경 시스템 (CNS) 내에서 매우 풍부한 glial 세포 유형입니다. 수용 성 synaptogenic 요인의 세포 외 기질 (ECM) 분 비를 통해 이다 설립 및 개발1동안 성숙한 시 냅 스의 클러스터링에 도움이. 그들은 또한 건강과 extracellular 신호2,3,,45, 시 냅 스의가 소성 유지에 중요 한 역할을 하 고 항상성의 장기 안정성을 세포 외 칼륨과 조미료, 뿐만 아니라 에너지 기질과 ATP6,,78의 분 비를 조절 하 여 환경. 마지막으로, 그들은9, extrasynaptic 전류 영향을 미치는 의해 neurotransmission에 기여할 수 있는 고 수 직접 다른 세포 유형 myelination10홍보 등을 통해 활동 영향. 중요 한 것은, 비정상적인 또는 이다의 부전 이어질 수 많은 neurodevelopmental 증후군 성인 neuropathology, 이므로 개선에 대 한 순서로 함께 설계 된 신경망에서 뉴런 이다를 포함 하는 명백한 필요가 내 생 두뇌 환경 모델입니다. 이다의 필수적인 특성 신경 시 냅 스1,,1112양식 동적 상호 작용을 그들의 능력입니다. 명과의 부재에서 신경 시 냅 스, 일반적으로 또한 기능 성숙13부족의 제한 된 수를 형성 한다.

인간의 이다 표시, transcriptional, 형태학 및 기능적 특성-분기, 뿐만 아니라 종의 유전자의 증가 크기와 복잡성 등-는 설치류12,14에 지 하지는 15. 그 결과, 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC)를 활용 하 여 연구-파생된 신경 세포 소설 치료, 부상, 모델과 문화 패러다임16 개발 하는 동안 생체 외에서 CNS 관련 질병 검사의 수단으로 널리 수용 되는 ,17. 또한, hPSCs 인간 시 냅 스 형성 및 기본 조직18,19에 대 한 필요 없이 기능 연구를 허용합니다.

시 냅 스 회로 기능에 기여 하는 다양 한 세포 유형 및 신호에 대 한 우리의 이해에 방 벽은 인간 두뇌의 관련 모델의 부족 이다. 높은 정확도와 재현성의 시 냅 스 네트워크를 정리 하는 적절 한 플랫폼에 대 한 필요가 있다. 최근, 관심 3D 문화 시스템의 생산에서 나왔다 (‘organoids,’로 널리 알려진 ‘spheroids,’ 또는 ‘미니 두뇌’) 휴대 및 매크로 수준에서 구조 하는 복잡 한 3 차원 (3D)를20 . 3D 문화 시스템은 일반적으로 결 석 하 또는 제한 된 일반적인 2D coculture 패러다임21,22동안 ECM 및 셀 상호 작용을 유지 합니다. 기술의 풍부한 3D 신경 spheroids23,,2425; 경작에 대 한 존재 그러나, 많은 긴 문화 기간 필요 (년 개월) 자연 개발 및 레이어 보존, 사용자 아주 작은 제어할 출력 전시.

여기, 우리가 설명 하는 체계적인 방법을 빠르게 하 고 지속적으로 여러 세포 유형 (사전 차별화 된 뉴런을 이다) 간의 bioengineer 신경 상호 작용 영역 cocultures (‘소행성’)26으로 셀을 조립 하 여 hPSCs에서 파생 된 는 정리 차원에서 인간의 특정 형태학 복잡. 이 고밀도 신경 시스템 균등 하 게 분산 된 신경 하위 시간이 지남에 성숙한 속성에 걸릴 하 고 상영 하거나 높은 처리량 방식에서 분석을 생성 합니다. 처음으로 인간의 이다 이러한 3D cocultures에서 시 냅 스 네트워크 버스트 활동 유도 대 한 설명 합니다. 또한,이 프로토콜은 다른 크기, CNS의 다른 지역 id에 지정 된 셀을 사용 하 고 여러 다른 종류의 세포로 원하는 상호 작용을 공부 하는 분야를 생성에 쉽게 적응.

Protocol

1. 세포 문화 및 시 약 준비 참고:이 섹션에서는 프로토콜은 분화 프로토콜 (제 2)에 표시 되는 순서에 따라 작성 됩니다. 재료와 카탈로그 번호에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 세포 배양에 대 한 코팅된 접시를 준비 합니다. 세포 외 기질 (ECM) 코팅 솔루션 DMEM/F12 미디어 준비 1 mg/mL 재고 솔루션을 희석. Aliquot 희석된 ECM 솔루션 …

Representative Results

제대로 수행 하는 경우이 프로토콜으로 이다28,33,34 와 뉴런35 (그림 1A-1C), hPSCs에서 생성 된 기능 cocultures의 정의 된 인구를 생산할 예정 이다 26 이전 상세 하 고 여기에 설명 된 단계 2.1-2.2. 이 단계적 절차, microwell 접시를 사용 하 여…

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 신경 cocultures의 3D 분야의 생산을 위한 체계적인 방법을 설명합니다. 분야 이다와는 독립적으로 파생 hPSCs에서 뉴런으로 구성 됩니다. 비록 하지이 프로토콜의 초점, 이다 hPSCs28 에서 순수한 인구의 세대는 중요 한 단계 이며 사전 경험 없이 수행 하는 경우에 기술적으로 도전적 일 수 있다. 이러한 시 냅 스 칩의 세대에서이 첫 번째 단계는 세심 한 타이밍 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 박사 마이클 워드 (NIH)에 대 한 기술적인 조언 iNeuron 차별화, 그리고 사바 Barlas 예비 이미지 분석에 대 한 이러한 절차의 디자인에 지적 입력을 위한 박사 에릭 Ullian (UCSF)를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
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References

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Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
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