Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode d’une micropipette pour appliquer directement une force contrôlée dans le noyau dans une cellule vivante. Ce dosage permet aux interrogatoires des propriétés mécaniques nucléaires dans la cellule vivante, adhérente.
Abstract
Les propriétés mécaniques du noyau déterminent sa réponse aux forces mécaniques générées dans les cellules. Parce que le noyau est moléculairement continu avec le cytosquelette, les méthodes sont nécessaires pour sonder son comportement mécanique dans les cellules adhérentes. Ici, nous discutons la sonde force directe (DFP) comme outil d’employer la force directement vers le noyau dans une cellule adhérente vivante. Nous attachons une micropipette étroite à la surface nucléaire avec aspiration. Une micropipette est traduite loin du noyau, ce qui provoque le noyau à déformer et à traduire. Lorsque la force de rappel est égale à la force d’aspiration, le noyau se détache et élastique se détend. Parce que la pression d’aspiration est connue avec précision, la force sur la surface nucléaire est connue. Cette méthode a révélé que les forces de la nano-échelle suffisent à déformer et à traduire le noyau dans les cellules adhérentes et identifié des éléments du cytosquelette qui permettent le noyau à résister aux forces. Le DFP peut servir à disséquer les contributions des composantes cellulaires et nucléaires nucléaire propriétés mécaniques dans les cellules vivantes.
Introduction
Pathologies telles que le cancer impliquent des modifications de forme nucléaire et composition1,2, qui sont généralement accompagnés par un ramollissement du noyau3,4. La résistance à la déformation mécanique nucléaire a été généralement caractérisée en appliquant une force de noyaux isolés5.
Le noyau dans les cellules est moléculairement relié au cytosquelette par l’éditeur de liens de Nucleoskeleton et cytosquelette (LINC) complexe6,7,8,9. Ainsi, le noyau est mécaniquement intégré avec le cytosquelette et, à travers les adhérences cellule-substrat, la matrice extracellulaire. Mécaniquement sonder le noyau à l’intérieur de cellules adhérentes peut donner un aperçu de cette intégration mécanique. Méthodes pour manipuler des noyaux dans les cellules vivantes incluent une micropipette aspiration10,11et la microscopie de force atomique12,13,14. Nous avons récemment décrit une sonde de force directe (DFP) qui s’applique à des forces mécaniques directement sur le noyau en une vie cellulaire adhérente15.
Ici, nous décrivons la procédure d’utilisation d’un système de micro-injection qui est couramment disponible dans les installations de microscopie d’appliquer une force mécanique de nano-échelle connue, directement vers le noyau dans une cellule adhérente. Un femtotip (0,5 µm de diamètre micropipette Astuce) est monté et raccordé au système de micro-injection par un tube. La pointe, placée à un angle de 45° par rapport à la surface de la boîte de Petri, est abaissée jusqu’à adjacente à la surface nucléaire. Le tube est ensuite déconnecté et ouvert à l’atmosphère, ce qui crée une dépression d’aspiration sur la surface nucléaire et scelle l’embout de micropipette contre la surface nucléaire. D’une traduction de la pointe d’une micropipette, le noyau est déformé et éventuellement (en fonction de l’ampleur de la force appliquée), détaché de la micropipette. Ce détachement se produit lorsque les forces de restauration (résister), exercées par le noyau et la cellule, égale à la force d’aspiration de la micropipette. Analyse peut être réalisée en mesurant le déplacement du noyau, la souche de longueur (équation 1), ou la souche de la région (Figure 1 a).
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesurer l’intégration mécanique du noyau avec le cytosquelette est un défi pour les méthodes plus récentes, par exemple une micropipette aspiration16, car ils nécessitent deux noyaux isolés (où le noyau est découplé du cytosquelette) ou noyaux dans les cellules suspendues (où les forces extracellulaires, telles que les forces de traction, sont absents). Force a été appliquée au noyau en appliquant biaxiale souche aux adhérentes de cellules à une membrane17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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