Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

Summary

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Abstract

Con la creciente prevalencia de enfermedades neurodegenerativas, es cada vez más importante comprender la fisiopatología subyacente que conduce a la pérdida y disfunción neuronal. Tecnologías y herramientas de imágenes basadas en fluorescencia permiten análisis sin precedentes de los procesos neurobiológicos subcelulares, pero todavía hay una necesidad de enfoques imparciales, reproducibles y accesibles para extraer datos cuantificables de los estudios por imágenes . Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios por imágenes basados en fluorescencia usando modelos de Drosophila de la neurodegeneración. Específicamente, se describe un enfoque fácil de seguir, semiautomático con Fiji/ImageJ para analizar dos procesos celulares: en primer lugar, cuantificar el contenido total de proteína y perfil en el lóbulo óptico de Drosophila mediante etiquetado fluorescente mutante proteínas huntingtina; y en segundo lugar, evaluar flujo de autofagia-lisosoma en el sistema visual de Drosophila con cuantificación basada en radiométrica de un reportero fluorescente de tándem de la autofagia. Importante, el protocolo descrito aquí incluye un paso de segmentación semiautomática para asegurar que todas las estructuras fluorescentes se analizan para reducir al mínimo el sesgo de selección y para aumentar la resolución de comparaciones sutiles. Este enfoque puede ser extendido para el análisis de otras estructuras biológicas de la célula y procesos implicados en la neurodegeneración, como proteico puncta (gránulos de estrés y complejos sinápticos), compartimentos, así como unida a la membrana (mitocondrias y vesículas tráfico de membrana). Este método proporciona un estándar, pero adaptable punto de referencia para análisis de imagen y cuantificación y podría facilitar la confiabilidad y reproducibilidad a través del campo y en última instancia, mejorar la comprensión mecanicista de la neurodegeneración.

Introduction

Las enfermedades neurodegenerativas afectan a millones de personas cada año y la incidencia está aumentando con un envejecimiento población¹. Mientras que cada enfermedad neurodegenerativa tiene una etiología única, agregación de proteínas mal plegadas y avería de la red proteostasis son características distintivas patológicas común de muchas de estas enfermedades. Dilucidar cómo la interrupción de estos procesos fundamentales e interrelacionados va mal contribuir a la muerte neuronal de la célula y disfunción es fundamental para entender las enfermedades neurodegenerativas, así como orientar las intervenciones terapéuticas. La proyección de im....

Protocol

1. consideraciones y preparados para diseñar el experimento de análisis de imagen

1. Predeterminar conveniente anatómico, celular, subcelulares marcadores o para servir como puntos de referencia para la estandarización de una región de interés (ROI) a través de diferentes muestras, por ejemplo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), marcadores de membrana, localizada fluorescente proteína, etc.
2. Seleccione un marcador fluorescente que puede delimitar puncta discreta más allá de los niveles de fondo de la estructura de interés.
   Nota: Este protocolo está optimizado para estructuras proteicos (por ejemplo, agregados de proteínas mal p....

Results

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de etiquetado agregados Htt mutantes en el lóbulo óptico de Drosophila , número y zona

Para investigar la agregación de proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central de un modelo de Drosophila de la enfermedad de Huntington, etiquetado RFP mutante humano Htt con expansión patológica ( o no patológico (UAS-RFP-hHttQ15) UAS-RFP-hHttQ138) y me.......

Discussion

El protocolo descrito aquí puede utilizarse para robusta y reproducible cuantificar procesos biológicos celulares visualizados por la proyección de imagen basada en fluorescencia. Contexto biológico y limitaciones técnicas necesitan ser cuidadosamente considerados para orientar el diseño experimental. Marcadores fluorescentes de estructuras subcelulares de interés, si immunohistochemical, teñir-basada, o genético expresado deben ser distinguibles sobre fondo de morfología e intensidad. El sistema de GAL4/UAS es .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYLGARD(R) 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning Corporation	PF184250	Plato de disección
Falcon 35 mm sin tratamiento TC Estilo de fácil agarre Placa de Petri bacteriológica	Corning	351008	Plato de disección
Dumont #5 Pinzas Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20	Herramienta de disección
Cloruro de sodio	Sigma	S3014	Solución
PBSFosfato de sodio Dibásico	Sigma	S5136	Solución PBS
Fosfato de potasio Monobásico	Sigma	P5655	Solución PBS
Triton  X-100	Sigma	T9284	Solución de lavado e incubación de anticuerpos.
Formaldehído al 37%	VWR	10790-710
Tubos de microcentrífuga desechables de fijación (0,5 ml, azul)	VWR	89000-022	Fijación, lavado e incubación de anticuerpos.
Micro portaobjetos lisos y esmerilados (25 veces; 75mm)	VWR	48312-004	Portaobjetos para imagen confocal
Micro Cover Glasses, rectangulares (22 veces; 40mm)	VWR	48393-172	Portaobjetos para imágenes confocales
Caucho Cemento	Slime	1051-A	Montaje
VECTASHIELD Antifade Montaje	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Montaje
Scotch Magic 810 Cinta Invisible (19mm× 25.4m)	3M Company	810	Montaje
suero de cabra normal	Thermo Fisher Scientific		PCN5000 incubadora
de anticuerpos DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Tinción de ácidos nucleicos. Disolver en agua desionizada para hacer una solución madre de 5 mg/mL y almacenar a -80 °C. Diluir hasta una concentración de trabajo de 10 a 20 °C; g/mL en PBTx.
Microscopio industrial de inspección con zoom estéreo 3.5X-90X AmScope		SM-1BNZ	Visor de disección. Equipado con 6W LED Dual Gooseneck Illuminator
ImageJ / Fiji	NIH	v1.51u	Con SCF_MPI_CBG complementos (versión 1.1.2)
FV1000-IX81 Microscopio de escaneo láser confocal	Olympus
Recombinant Construct	Bloomington Drosophila Stock Center	BL37749