Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.
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Methodenartikel
Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bei aktiven präsynaptischen nervenausgänge unterziehen synaptischen Vesikel Zyklen von Exo und Endozytose. Beim recycling, der luminalen Domänen des SV transmembranen Proteine an der Zelloberfläche ausgesetzt. Eines dieser Proteine ist Synaptotagmin-1 (Syt1). Ein Antikörper gegen der luminalen Domäne der Syt1, einmal hinzugefügt, um dem Kulturmedium wird während des Exo-endocytotic Zyklus aufgegriffen. Diese Aufnahme ist proportional zur Menge des SV recycling und durch Immunfluoreszenz quantifiziert werden kann. Hier verbinden wir Syt1 Antikörper Aufnahme mit doppelten Transfektion von kultivierten hippocampal Neuronen. Dies ermöglicht uns (1) lokalisieren präsynaptischen Websites basierend auf Ausdruck der rekombinanten präsynaptischen Marker Synaptophysin, (2) bestimmen ihre Funktionalität mit Syt1 Aufnahme und (3) charakterisieren das Zielen und Wirkungen eines Proteins des Interesses, GFP-Rogdi.
Einleitung
Studium der synaptischen Vesikel recycling ist wichtig bei der Bestimmung, wie präsynaptischen Eigenschaften, während Synaptische Plastizität oder in Reaktion auf die Störung der synaptischen Funktion verändern. Antikörper-Aufnahme bietet Studium Synaptotagmin-1 (Syt1) eine Methode zur Messung der Menge von recycling-SV. Syt1 ist ein SV-assoziierten Protein, das wirkt wie ein Ca2 + Sensor und ist notwendig für steht Freisetzung von Neurotransmitter-1,-2. Es ist ein transmembranen Protein mit einer C-terminalen cytoplasmatischen Domäne außerhalb der SV und eine N-terminale luminalen Domäne innerhalb ....
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Protokoll
Keine Studien mit lebenden Tieren wurden durchgeführt. Experimente mit euthanasierten Tiere, um die Zelle zu erhalten, die Kulturen von den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zustimmung genehmigt wurden Nummer T10/30. Die Experimente wurden mit der genehmigten Protokolle geführt.
1. primäre Hippocampal Zellkultur
- Bereiten Sie die dissoziierten Zellkultur der Ratte Hippocampus am embryonalen Tag 1916,17. Die Zellen auf 12 mm Deckgläsern beschichtet mit Polyethyleneimine (PEI) in 24 Wohlen Teller bei einer Dichte vo....
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Ergebnisse
Ein erwartetes Ergebnis dieses Ansatzes ist ca. 50 Doppel-transfizierten Neuronen pro Deckglas bei einer Dichte von 50.000 Neuronen pro Bohrloch Auffinden. Das Axon jedes Neuron wird voraussichtlich mehrere Hotspots fluoreszent markiert Synaptophysin Akkumulation, Angabe Cluster OfSVs zeigen. Funktionale präsynaptischen Standorten colocalizes das rekombinante Synaptophysin Signal mit punktförmige Syt1 Fluoreszenz. Verwenden doppelte Transfektion, ist GLP-Rogdi als das Protein des Interess.......
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Diskussion
Es gibt drei Tests routinemäßig zur synaptischen Vesikel (SV) recycling zu studieren. Die ersten beiden umfassen die Verwendung von einem) fluoreszierende Styryl Farbstoffe wie FM1-43 (die in Membranen zu integrieren, sind in den Organellen während Endozytose aufgenommen und werden nach Exozytose freigesetzt); und b) eindringmittel getaggt rekombinante SV-Proteine (die bei Überexpression, in die proteinhaltige recycling Maschinen integrieren). Wenn die angehängte Fluorophore ihre Fluoreszenz je nach pH-Wert ändern, diene.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Irmgard Weiss für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der DFG über des Exzellenzclusters für Mikroskopie im Nanometerbereich und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB, B1-7, T.D) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| Esel Anti Maus Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | Antikörper |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf Röhrchen | Eppendorf | 30120094 | |
| Multiwell 24 Well | Fisher Scientific | 087721H | |
| Röhrchen (50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glukose | Merck | 1.083.421.000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| Objektträger | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Kostenlose Software, siehe Kommentare | geschrieben von Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| Sicherheitshaube | ThermoElectron | Serien-Nr. 40649111 | |
| Saccharose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 Synaptische | Systeme | 105311 | Maus monoklonal; Klon 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1.086.031.000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Wasserbad | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
Referenzen
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-6....
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Nachdrucke und Genehmigungen
