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Genetics

जैविक संस्कृतियों को बनाए रखने और Aphis neriiमें जीन अभिव्यक्ति को मापने: संयंत्र के लिए एक गैर मॉडल प्रणाली-कीट बातचीत

Published: August 31, 2018
doi:
10.3791/58044
, ,
1Biological Sciences Department,Vanderbilt University

Summary

एफ़िड Aphis nerii उपनिवेश करता dogbane परिवार (Apocyanaceae) में अत्यधिक बचाव संयंत्रों पर और संयंत्र कीट बातचीत के अध्ययन के लिए कई अवसर प्रदान करता है । यहां, हम संयंत्र और एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं, और एक. neriiके लिए और आणविक और-omic डेटा की पीढ़ी और विश्लेषण ।

Abstract

एफ़िड्स symbioses के विकास से लेकर जैविक सवालों की एक किस्म के लिए उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल और polyphenisms के अपने मेजबान संयंत्रों के साथ कीट बातचीत आसपास के सवालों के लिए कर रहे हैं । जीनोमिक संसाधनों कई एफ़िड प्रजातियों के लिए उपलब्ध हैं, और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में अग्रिम के साथ, transcriptomic अध्ययन गैर मॉडल जीवों कि कमी जीनोम के लिए बढ़ाया जा रहा है । इसके अलावा, एफ़िड संस्कृतियों क्षेत्र से एकत्र किया जा सकता है और शरीर और आणविक प्रयोगों में उपयोग के लिए प्रयोगशाला में पीछे की पारिस्थितिकी और आनुवंशिक अध्ययन के बीच की खाई को पाटने के लिए । पिछले, कई एफ़िड्स सदा, parthenogenic जीवन asexually reproducing पादी की तुलना के लिए अनुमति चक्र में अपने पसंदीदा मेजबान संयंत्रों पर प्रयोगशाला में बनाए रखा जा सकता है । Aphis nerii, milkweed-ओलियंडर एफ़िड, दोनों जीव और आणविक प्रयोगों का उपयोग कर विषाक्त पौधों के साथ कीट बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक ऐसा मॉडल प्रदान करता है । पीढ़ी और संयंत्र और ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला, डीएनए और आरएनए निकालने, माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण, डी नोवो transcriptome विधानसभा और एनोटेशन, transcriptome अंतर अभिव्यक्ति में एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए तरीके विश्लेषण, और विभेदक व्यक्त जीन के qPCR सत्यापन रेखांकित और यहां चर्चा कर रहे हैं ।

Introduction

एफ़िड्स छोटे, hemimetabolous कीड़े है कि दुनिया भर में विविध संयंत्र परिवारों पर उपनिवेश हैं । वे कई सुविधाओं के लिए विशिष्ट हैं, सबसे विशेष रूप से अपने जटिल जीवन चक्रीय अनिषेकजनन और असतत polyphenisms शामिल चक्र, और बैक्टीरियल या खमीर endosymbionts कि आपूर्ति से लापता पोषक तत्वों के साथ उनके बाध्य पोषण symbioses संयंत्र के अपने आहार एसएपी1। जबकि सबसे एफ़िड्स मेजबान संयंत्र विशेषज्ञ हैं, कुछ महासचिव प्रजातियों महत्वपूर्ण फसल कीट हैं, या तो सीधे या रोगजनकों और वायरस वे2वेक्टर के माध्यम से फसलों पर काफी आर्थिक क्षति को दण्डित । २०१० में पहली एफ़िड जीनोम के प्रकाशन, मटर एफ़िड Acyrthosiphon pisum3, एफ़िड जीवविज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर के रूप में चिह्नित है क्योंकि यह कीट के बारे में सवालों के समाधान के लिए जीनोमिक संसाधन प्रदान शाकाहारी जीवन शैली के लिए रूपांतरों, उन है कि एक बेहतर नियंत्रण रणनीतियों4के लिए नेतृत्व कर सकते है सहित । उस समय के बाद से, अतिरिक्त जीनोमिक संसाधनों सोयाबीन एफ़िड Aphis glycines5के लिए एक व्याख्या जीनोम के प्रकाशन के साथ जमा है, और सार्वजनिक रूप से एक और तीन के लिए उपलब्ध पूरे जीनोम संसाधन एफ़िड प्रजातियों (Myzus cerasi (black चेरी एफ़िड), Myzus persicae (आड़ू-आलू एफ़िड), Rhopalosiphum padi (बर्ड चेरी-जई एफ़िड)6. मूल्यवान डी नोवो transcriptomic संसाधनों के रूप में अच्छी तरह से अंय एफ़िड प्रजातियों की एक संख्या के लिए उपलब्ध है (जैसे, Aphis gossypii (कपास एफ़िड)7, Sitobion avenae (अनाज एफ़िड)8, Cinara pinitabulaeformis (पाइने एफ़िड)९, Aphis nerii (milkweed-ओलियंडर एफ़िड)१०).

एफ़िड्स भी संयंत्र की हमारी समझ में स्थाई योगदान किया है कीट बातचीत और11पौधों पर जीवन की पारिस्थितिकी । एक क्षेत्र है जहां एफ़िड्स विशेष रूप से महत्वपूर्ण योगदान किया है मेजबान संयंत्र बातचीत के रासायनिक पारिस्थितिकी की हमारी समझ में है । शाकाहारी कीड़ों संयंत्र गढ़ पर काबू पाने के लिए विविध रूपांतरों एक्सप्रेस, और कुछ भी सह अपने स्वयं के लाभ के लिए संयंत्र गढ़ ऑप्ट12,13,14। उदाहरण के लिए, milkweed-ओलियंडर एफ़िड, Aphis nerii, एक चमकीले पीले, इनवेसिव एफ़िड दुनिया भर में शीतोष्ण और उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में पाया जाता है कि उपनिवेश करता परिवार (milkweed) में पौधों पर Apocynaceae है । परिवार Apocynaceae में पौधों दूधिया लेटेक्स और कार्डियक glycosides cardenolides के रूप में जाना सहित विविध रासायनिक गढ़, विकसित किया है, कि कटियन वाहक ना, K-ATPase बांध और15 शाकाहारी महासचिव को प्रभावी निवारक हैं, 16. Milkweed विशेषज्ञों cardenolides करने के लिए प्रतिरोध के विभिंन तरीकों व्यक्त करते हैं, और कुछ चुनिंदा या निष्क्रिय जमा या cardenolides को एक साधन के रूप में अपने ऊतकों में संशोधित predation रोकते या अंय लाभ के लिए17। ए nerii इस तरह से cardenolides एकांत करने के लिए सोचा है, हालांकि तंत्र और कार्यात्मक लाभ स्पष्ट नहीं रह10,18।

हाथ में जीनोमिक संसाधनों को देखते हुए, एक. nerii आणविक और आनुवंशिक chemo में शामिल तंत्र के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है-विषाक्त मेजबान संयंत्रों और उनके विशेषज्ञ शाकाहारी के बीच पारिस्थितिकी बातचीत । यह ध्यान देने योग्य बात है कि, जबकि cardenolides19की ज़ब्ती पर ध्यान केंद्रित एक. nerii के प्रारंभिक अध्ययन के कुछ है, उस समय के बाद से, एक. nerii के अध्ययन विकासवादी और पारिस्थितिक सवालों का एक व्यापक सेट में अंतर्दृष्टि प्रदान की है, इनवेसिव कीड़े की आनुवंशिक संरचना20 और नीचे अप और शाकाहारी घनत्व21पर ऊपर से नीचे नियमन के बीच एक साथ खेलना शामिल है । a. nerii इस प्रकार कीट-पादप इंटरैक्शन के अध्ययनों का एक विशेष रूप से व्यापक सेट के लिए एक प्रायोगिक मॉडल के रूप में एक अच्छा उंमीदवार है । ए. nerii के साथ किसी भी अध्ययन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण एफ़िड आबादी के सावधान संस्कृति है, जो पौधों की संस्कृति है जिस पर एफ़िड्स निर्भर है, साथ ही साथ उच्च गुणवत्ता वाले omic डेटा के एक कुशल पीढ़ी भी शामिल है । हमारा लक्ष्य दोनों के माध्यम से पाठक गाइड है । नीचे उल्लिखित पीढ़ी और संयंत्र और ग्रीनहाउस और प्रयोगशाला, डीएनए और आरएनए निकालने, माइक्रोसेटेलाइट विश्लेषण, डी नोवो transcriptome विधानसभा और एनोटेशन, transcriptome में एफ़िड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए तरीके हैं विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण, और अंतर व्यक्त जीन के qPCR सत्यापन । हालांकि इन पद्धतियों के लिए एक. nerii, सामांय संवर्धन, निष्कर्षण और विश्लेषण विधियों के लिए लिखा है एफ़िड प्रजातियों में से एक किस्म का विस्तार कर सकते हैं ।

Protocol

1. संयंत्र संस्कृतियों किसी भी वाणिज्यिक विक्रेता से बीज खरीद या क्षेत्र में परिपक्व पौधों से इकट्ठा ।नोट: इस प्रोटोकॉल सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध milkweed प्रजातियों के लिए उपयुक्त है (जैसे, Asclepias inc…

Representative Results

संयंत्र संस्कृतियों: बीज लगभग दो से चार सप्ताह लगेंगे, मौसम पर निर्भर करता है, के लिए काफी बड़ा हो जाना फिर से कमरों का (1 चित्रा) । फिर से कमरों का अंकुरित एफ़िड संस्कृ…

Discussion

यह लंबे समय से मांयता प्राप्त है कि aposematic A. nerii पैटर्न और संयंत्र गढ़ और विशेष रूप से रासायनिक ज़ब्ती प्रतिरोध के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है18,३७। जीनोमिक संसाधनों की …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम फोटोग्राफी के साथ सहायता के लिए मिशेल मून (वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय फिलीस्तीनी अथॉरिटी और SSLB को समर्थन प्रदान की डीजीई-१४४५१९७ द्वारा समर्थित है ।

Materials

Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659
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References

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Birnbaum, S. S., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).
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