Att upprätthålla biologiska kulturer och mäta genuttryck i Aphis nerii: icke-modellsystem för växt-insekt interaktioner
Summary
Bladlöss Aphis nerii colonizes på starkt försvarade växter i familjen Alyxia (Apocyanaceae) och ger många möjligheter att studera växt-insekt interaktioner. Här presenterar vi en serie av protokoll för underhåll av anläggningar och bladlöss kulturer, och generation och analys av molekylära och – miska data för A. nerii.
Abstract
Bladlöss är utmärkta experimentella modeller för en mängd olika biologiska frågor alltifrån utvecklingen av Symbiosar och utvecklingen av polyphenisms till frågor kring insektens interaktioner med sina värdväxter. Genomisk resurser finns tillgängliga för flera bladlöss arter, och framstegen inom nästa generations sekvensering, transcriptomic studier förlängs till icke-modellorganismer som saknar genomen. Dessutom kan bladlöss kulturer samlas från fältet och uppfödda i laboratoriet för användning i organismer och molekylär experiment för att överbrygga klyftan mellan ekologiska och genetiska studier. Senast, många bladlöss kan upprätthållas i laboratoriet på deras föredragna värdväxter i evig, parthenogenic livscykler som möjliggör jämförelser av asexuellt reproduktion genotyper. Aphis nerii, den milkweed-oleander bladlöss, ger en sådan modell för att studera insekt interaktioner med giftiga växter med hjälp av både organismer och molekylär experiment. Metoder för generering och underhåll av anläggningar och bladlöss kulturerna i växthus och laboratorium, DNA och RNA extraktioner, mikrosatellit analys, de novo transkriptom montering och annotering, transkriptom differentiell uttrycket analys och qPCR verifiering av Differentiellt uttryckta gener är beskrivs och diskuteras här.
Introduction
Bladlöss är små, hemimetabolous insekter som koloniserar på olika växtfamiljer i hela världen. De är utmärkande för flera funktioner, mest särskilt deras komplexa livscykler som involverar cykliskt partenogenes och diskreta polyphenisms och deras obligata näringsmässiga symbios med bakterier eller jäst endosymbionts som levererar näringsämnen som saknas från deras kost växt sap1. Medan de flesta bladlöss är värd växten specialister, vissa generalist arter är viktig gröda skadedjur, orsakar stora ekonomiska skador på grödor antingen direkt eller via patogener och virus de vektor2. Offentliggörandet av det första bladlöss genomet i 2010, den ärt bladlöss Acyrthosiphon pisum3, markerade en viktig milstolpe i studiet av bladlöss biologi eftersom det föreskrivs att ta itu med frågor om insektens genomisk resurser anpassningar till de växtätande livsstil, inklusive sådana som kan leda till en bättre kontroll strategier4. Sedan dess har har ytterligare genomisk resurser samlat med publikationen av en kommenterad arvsmassa för sojabönor bladlöss Aphis glycines5och offentligt tillgänglig hela genomet resurser för en annan tre-bladlöss arter (Myzus Cerasi (svarta körsbär bladlöss), Myzus persicae (persika-potatis bladlöss), Rhopalosiphum padi (Häggen-oat bladlöss)6. Det finns värdefulla de novo transcriptomic resurser samt för ett antal andra bladlöss arter (e.g.,Aphis gossypii (bomull bladlöss)7, Sitobion avenae (korn bladlöss)8, Cinara pinitabulaeformis (pine bladlöss)9, Aphis nerii (milkweed-oleander bladlöss)10).
Bladlössen har också gjort bestående bidrag till vår förståelse av de växt-insekt interaktionerna och ekologi av livet på växter11. Ett område där bladlöss har gjort särskilt viktigt bidrag är i vår förståelse av de värd-växt interaktionerna kemisk ekologi. Växtätande insekter express olika anpassningar nytta för att övervinna växt försvar, och vissa även adjungera växt försvar för sin egen12,13,14. Den milkweed-oleander bladlöss, Aphis nerii, är exempelvis en ljus gul, invasiva bladlöss hittade i tempererade och tropiska regioner i världen som colonizes på växter i familjen milkweed (oleanderväxter). Växter i familjen oleanderväxter har utvecklats olika kemiska försvar, inklusive mjölkaktig latex och hjärtglykosider som kallas cardenolides, som binder ering transportören Na, K-ATPas och är effektivt avskräckningsmedel till generalist växtätare15, 16. milkweed specialister uttrycka olika lägen av resistens mot cardenolides, och några selektivt eller passivt samla eller ändra cardenolides i sina vävnader som ett sätt att avskräcka predation eller för andra förmåner17. A. nerii tros binda cardenolides på detta sätt, även om mekanismerna och funktionella fördelar förblir oklart10,18.
Genomisk resurser till hands ger, A. nerii en utmärkt experimentell modell för att studera de molekylära och genetiska mekanismerna som är involverade i chemo-ekologiska samspelet mellan giftiga värdväxter och deras specialiserade växtätare. Det är värt att notera att medan några av de tidigaste studierna av A. nerii fokuserade på kvarstad cardenolides19, sedan dess har studier av A. nerii har gett insikter i en bred uppsättning evolutionära och ekologiska frågor, inklusive den genetiska strukturen hos invasiva insekter20 och samspelet mellan bottom-up och top-down förordning på växtätare densitet21. A. nerii är således en bra kandidat som en experimentell modell för en särskilt breda studier av insekt-växt interaktioner. Kritisk till framgång för någon studie med A. nerii är försiktig kulturen av bladlöss befolkningar, som omfattar växter som bladlöss är beroende av kultur, liksom en effektiv generering av hög kvalitet – miska data. Vårt mål är att vägleda läsaren genom båda. Beskrivs nedan är metoder för generering och underhåll av anläggningar och bladlöss kulturerna i växthus och laboratorium, DNA och RNA extraktioner, mikrosatellit analys, de novo transkriptom församling och annotering, transkriptom differentiell uttryck analys och qPCR verifiering av differentially uttryckt gener. Medan dessa metoder är skrivna för A. nerii, allmän odling, utvinning och analysmetoder kan omfatta en mängd bladlöss arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har länge setts som aposematic A. nerii kan ge insikter i mönster och resistensmekanismer växt försvar och särskilt kemiska bindning18,37. Ett antal genetiska resurser har nyligen dykt upp för A. nerii10, erbjuder nya möjligheter för ekologiska och funktionella genetiska studier som använder A. nerii som en modell. Vi beskriva grundläggande protokoll i bladlöss och plant kultur och molekylär/genom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Michelle Moon (Vanderbilt University) för hjälp med fotografering. Vanderbilt University tillhandahålls stöd till PA och SSLB stöds av DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
References
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
- Dixon, A. F. G. . Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).
- Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
- Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
- Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Li, Z. -. Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
- Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
- Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
- Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
- Dixon, A. F. G. . Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).
- Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
- Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
- Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
- Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
- Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect’s perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
- Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
- Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems – a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
- Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
- Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid ‘superclone’: extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
- Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
- Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
- Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
- Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).
- The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
- Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
- Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
- Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
- Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
- Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
- Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
- Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
- Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).
