قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لدقة تحديد مقدار التعديلات الوراثية متعددة من المنطقة المستهدفة في رد فعل واحد استخدام دبكر الإنزال وزوج فريدة من المسابر التحلل المائي.
Abstract
التجميعية الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) أسلوب تفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز كمية حساسة للغاية تستند إلى وجود عينة إلى الآلاف من ردود الفعل الفردية الماء في النفط التي نانو الحجم. في الآونة الأخيرة، أصبح دبكر واحدة من الأدوات الأكثر دقة وحساسية لتعميم الورم كشف الحمض النووي (كتدنا). أحد القيود الرئيسية التي تقنية دبكر القياسي هو تقييد عدد الطفرات التي يمكن أن يكون فحص كل رد فعل، التي تلزم بتحقيقات محددة التحلل الاعتراف بكل إصدار الاليلي ممكن. منهجية بديلة، دبكر الإنزال، يزيد الإنتاجية، نظراً لأنها تتطلب فقط زوج واحد من تحقيقات لكشف وتحديد يحتمل أن تكون كافة التعديلات الوراثية في المنطقة المستهدفة. يعرض دبكر الإنزال حساسية قابلة للمقارنة لفحوصات دبكر التقليدية مع ميزة الكشف عن عدد أكبر من الطفرات في رد فعل واحد. فعالة من حيث التكلفة، ويحافظ على المواد الثمينة عينة، ويمكن أيضا استخدامها كأداة لاكتشاف عند حدوث طفرات غير معروفة مسبقاً.
Introduction
آلاف طفرات الجسدية المتصلة بالتنمية سرطان قد أبلغ عنها1. بين هؤلاء، هناك عدد قليل من علامات تنبؤية لفعالية العلاج المستهدفة 2،3 وفحص هذه الطفرات الوراثية الممارسة السريرية الروتينية الآن. الحبرية، التكنولوجيا الرقمية على بكر (دبكر) يمكن استخدامها لرصد للوجود أو عدم وجود الطفرات مع كشف عالية الدقة، وهو متوافق بشكل كبير مع خزعات السائلة غير الغازية4،5. ومع ذلك، تشنيع الحالية دبكر فحوصات للكشف عن الطفرات معروفة مسبقاً. وهذا يحد بشدة استخدام دبكر كأداة لاكتشاف عند الطفرة غير معروف. في الواقع، في تصميم دبكر التقليدية، مجس التحلل إذ تسلم اليل البرية من نوع (WT مسبار) تتنافس مع تحقيق محددة إذ تسلم اليل المسخ (موت مسبار) (الشكل 1A). التحقيق مع تقارب أعلى هيبريديزيس إلى القالب، والنشرات في فلوروفوري، مما يشير إلى طبيعة اليل المقابلة. يمكن تصور الأسفار البيانات التي تم الحصول عليها لكل قطره في مؤامرة مبعثر يمثلون الأسفار المنبعثة من المسابر WT وموت في أبعاد مختلفة. تمثيل تخطيطي لنتيجة نموذجية مقايسة دبكر تقليدية ترد في الشكل 1A. في هذا المثال، يناظر سحابة زرقاء قطرات تحتوي على الآليلات WT حددها التحقيق WT، بينما سحابة حمراء يطابق قطرات الذي تم تضخيمه اليل موت وحددها التحقيق موت. اعتماداً على كمية الحمض النووي محملة في رد الفعل، يمكن أن تظهر قطرات إيجابية مزدوجة تحتوي على أمبليكونس WT وموت (سحابة الخضراء). سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات فارغة.
حيث تسمح معظم المنصات للكشف عن عدد محدود من فلوروفوريس (عادة ما تكون 2، بل تصل إلى 5)، يقتصر إنتاجية دبكر التقليدية. ولذلك، استهداف المناطق مع الطفرات المتاخمة متعددة يتطلب تصميم تحديا تقنيا فحوصات دبكر متعدد أو استخدام ردود فعل متعددة تستهدف كل طفرة في نفس الوقت. الاستراتيجية دبكر الإنزال، ويتغلب على هذا القيد كما يحتمل أن يمكن الكشف عن أي تغيير الوراثية داخل منطقة مستهدفة استخدام زوج فريدة من المسابر التحلل WT. ومن المتوقع أول مجس (مسبار 1) يغطي تسلسل غير متغيرة، المتاخمة للمنطقة المستهدفة والتحقيق الثاني (المسبار 2) مكمل لتسلسل المنطقة المستهدفة حيث الطفرات WT (الشكل 1B). في حين أن التحقيق الأولى يقد المبلغ الإجمالي لجزيئات أمبليفيابل في رد الفعل، يميز التحقيق الثاني الآليلات WT وموت بالتهجين دون المستوى الأمثل لتسلسل متحولة. المسبار 2 يمكن تحديد أنواع متعددة من الطفرات في المنطقة (نوكليوتيد واحد أو عدة بدائل، الحذف، إلخ) الهدف6. كما هو الحال في دبكر التقليدية، سحابة رمادية خفيفة يطابق قطرات تحتوي على لا جزيئات الحمض النووي. من المهم أن نذكر أن الفصل الأمثل الغيوم WT وموت في هذا النوع من التحليل، تعتمد على الكمية من الحمض النووي محملة في رد الفعل، حيث لا يمكن تمييزها قطرات تحتوي على وزن وموت الآليلات الهدف من قطرات تحتوي على فقط وزن النموذج. ولذلك، يتطلب هذا التحليل أن معظم قطرات تحتوي على لا أكثر من نسخة واحدة من الجينات المستهدفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصميم مقايسة دبكر الإنزال كفاءة والأمثل الحاسم، والبروتوكول يجب أن تتبع بدقة. وقد كل تركيبة الإشعال والمسابير من كفاءة تفاعل PCR فريدة من نوعها. وهكذا، قد مقايسة فردية سيتم التحقق من عينات مراقبة بعناية قبل استخدامها في عينات اختبار قيمة. الأمثل والتحقق من الصحة مهمة التصديق على الكشف عن إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها معهد كوري SiRIC (منحة الإنكا-دجوس-4654). الكتاب أيضا أن أشكر حجو كارولين لمساهمتها في الفيديو.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
