ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.
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この記事について
サマリー
要約
液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応 (ddPCR) は、ナノサイズの水-油の個々 の反作用の数千にサンプル分別に基づく高感度の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法です。最近では、ddPCR は循環腫瘍 (葉緑体) DNA 検出の最も正確で重要なツールとなっています。標準的な ddPCR 技術の主要な限界の 1 つは、特定加水分解プローブ各対立遺伝子のバージョンを認識し、必要な反応あたり上映することができます変異数の制限です。別の方法、ドロップオフの ddPCR では、プローブで検出し、対象地域における潜在的すべての遺伝的変化を定量化するの 1 つのペアだけが必要なので、スループットが向上します。ドロップオフの ddPCR は、単一の反作用で突然変異の大きい数を検出の利点と従来の ddPCR の試金に匹敵する感度を表示します。コスト効率の高い、貴重な試料を節約、変異をアプリオリに知られていないとき検出ツールとして使用することができます。
概要
何千もの癌の開発に関連する体細胞突然変異は報告された1をされています。これらのうち、いくつかの標的療法2,3の有効性予測マーカー、遺伝のこれらの突然変異のスクリーニングは今日常診療。液滴デジタル PCR (ddPCR) の技術は高い検出精度と突然変異の有無を監視するため、非侵襲的な液体生検4、5と高い互換性。ただし、試金 ddPCR 現在主に先天的な知られている突然変異を検出する設計されています。突然変異が知られている場合、これは深刻な検出ツールとして ddPCR の使用が制限されます。確かに、従来の ddPCR デザインの野生型対立遺伝子 (WT プローブ) を認識し加水分解プローブは突然変異体の対立遺伝子 (MUT プローブ) (図 1 a) を認識し、特定のプローブと競合します。高い親和性プローブは、テンプレートに交配し、対応する遺伝子の性質を示す、その蛍光を解放します。各液滴の得られた蛍光データは、別の次元で WT とムトのプローブによって放出される蛍光を表す散布で視覚化できます。従来の ddPCR の試金のための典型的な結果の概略は、
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プロトコル
ここで提示されたプロトコルの Institut キュリーの倫理ガイドラインに従います。人間のすべてのサンプルは、インフォームド コンセント、Institut キュリー制度審査委員会で承認された研究の後、登録された患者から得られました。
1. 血液 DNA 抽出プラズマ ・ コレクション
注: 任意の種類の「組織」から抽出した DNA を使用できます (例えば、新鮮なまたはホルマリン固定パラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織、文化や血液の細胞)。ここでは、採血、プラズマ分離とストレージ、および細胞の DNA (cfDNA) の抽出の詳細な手順を提供します。
-
血のコレクションおよびプラズマのストレージ (図 2 b)
- 7 mL EDTA の管に血液サンプルを収集します。2 つの管は、プラズマの約 4 mL を収集するために推奨されます。
- 赤い血球 (RBC)、白血球 (WBC) とプラズマ分離する血液の 3 h 以内 820 x gで 10 分間のチューブを遠心します。サンプリングし、遠心分離の間の時間は、高品質の cfDNA (すなわち、 WBC からリリースされた DNA の....
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結果
概念実証研究 FFPE 組織やドロップオフ ddPCR 戦略6を使用して癌から血漿検体でKRASエクソン 2 変異 (コドン 12 と 13) とegfr 遺伝子エクソン 19 削除を調べた。
KRASドロップオフ プローブは、複数人間癌11既知のKRAS変異の 95% 以上あるのエクソン 2 のKRAS遺伝子の変異を含む 16 bp の領域を尋問しました。基準プローブは 20 bp の長さと位置 3 bp 下流。2 最も頻繁に変異したKRASのアミノ酸を含む細胞から抽出した DNA を用いて我々 の分析を最適化する: G12V (c.35GT、SW480) と G13D (c.38GA、HCT 116)。
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ディスカッション
効率的なドロップオフ ddPCR アッセイを設計、最適化が重要であり、プロトコルを慎重に従う必要があります。プライマーとプローブの各組み合わせが一意の PCR 反応効率。したがって、個々 のアッセイは、貴重な試料を使用する前にコントロールのサンプルを注意深く検証します。最適化、検証、ピーク信号検出を証明し、特異性と感度を評価する重要です。プロトコルに従って、「プローブ 2」によってカバーされる対象領域にあるすべての変異体潜在的尋問されることができます。「プローブ 2」の 5' または 3' 端に位置する突然変異の確認を推奨するそれにもかかわらずドロップオフの試金の効率に影響を与える可能性がありますこれら以来。
ここで紹介した方法は、FFPE 組織、文化や血液の細胞を含む、「組織」の任意の型から抽出した DNA を実行できます。ただし、核酸抽出の質は劇的に ddPCR の結果に影響を与えます。ヘパリン、蛋白質、ヘム、フェノール、プロテアーゼ、コラーゲン、メラニン、洗剤や塩などの PCR 阻害物質があるサンプリングと精製工程中に可能な限り除去します。DdPCR の PCR 阻害物質の影.......
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開示事項
何人かの著者を葉緑体の検出に関連する 2 つの特許出願 (EP17305920.5、EP18305277.8) の発明者と呼びます。
謝辞
この作品は、Institut キュリー SiRIC (グラント インカ DGOS 4654) によって支えられました。著者感謝したいまたキャロライン ヘゴ ビデオへの彼女の貢献のため。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| K2EDTAの管(色コード:ラベンダー) | BD | の367863 | EDTAの管が全血またはEDTA血漿サンプル |
| QIAampの循環核酸のキット(手動プロトコル) | Qiagen | 55114 | 人間の血漿からの自由な循環DNAの分離のため |
| QIAsymphony DSPの循環DNAのキット(自動化されたプロトコル) | Qiagen | 937556 | 人間の血漿からの自由な循環DNAの分離のため |
| QIAsymphony SPシステム | Qiagen | 9001297 | cfDNA、DNAまたはRNA精製のための完全統合および自動化システム |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | 最大24個のcfDNAを同時に精製 |
| Qubit蛍光光度計 | Invitrogen | Q33226 | Qubit蛍光光度計は、DNA |
| QX100またはQX200 | リーダーBio-Rad | の定量用のベンチトップ蛍光光度計です186-3003または186-4003 | 各液滴の蛍光強度を測定し、液滴が検出器を通過するときのサイズと形状を検出します |
| QX100またはQX200液滴発生器 | Bio-Rad | 186-3002または186-4002、それぞれ | 液滴生成に使用される機器 |
| C1000サーマルサイク | ラーBio-Rad | 1851196 | モジュール式サーマルサイクラープラットフォームには、C1000タッチサーマルサイクラーシャーシ、96ウェル高速反応モジュール |
| プレートシー | ラーBio-Rad | 181-4000 | PX1&tradeが含まれます。PCRプレートシーラー |
| DG8カートリッジホルダー | Bio-Rad | 186-3051 | 液滴発生のための装置内でDG8カートリッジを配置し、保持 |
| 液滴発生器カートリッジとガスケット | Bio-Rad | 186-4007 | マイクロ流体DG8カートリッジは、サンプルとオイルを混合して液滴を生成するために使用されます。DG8ガスケットは、蒸発を防ぎ、液滴形成に必要な圧力を適用するためにカートリッジをシール |
| PCRスーパーミックス | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR プローブ用スーパーミックス(dUTPなし) |
| 96ウェルPCRプレート | エッペンドルフ | 951020362 | 96ウェルセミスカートプレート |
| ホイルシール | Bio-Rad | 181-4040 | ピアス可能なホイルヒートシール |
| ddPCRドロップレットリーダー Oil | Bio-Rad | 186-3004 | に使用されるオイル |
| 用オイル | Bio-Rad | 186-3005 | 液滴生成用オイル |
| DNA loBind チューブ 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind チューブは、サンプルと表面の結合を大幅に減らすことにより、サンプル回収を最大化し |
| マルチプレックス I cfDNA リファレンス標準セット | HORIZON | HD780 | Multiplex I cfDNA Reference Standards は、体細胞変異を検出する cfDNA アッセイの性能を評価するために使用される、高度に特徴付けられた生物学的に関連する参照材料です |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | HS アッセイは、RNA 上の二本鎖 DNA (dsDNA) に対して高い選択性を持ち、10 pg/µ からの初期サンプル濃度に対して正確になるように設計されています。Lから100 ng /µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit Assay Tubesは500 µです。L 薄肉ポリプロピレンチューブ (Qubit Fluorometer と併用) |
参考文献
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic C....
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再版と許可
