העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב
Summary
טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות) הן בהערכה רציפה כדי לשפר את התוצאות ולהפחית את הסיכונים הקשורים. כתב יד זה מתאר הליך מינימלית פולשני העברת העובר עם פרוטוקול הקריוגנית יעיל המאפשר שימוש בארנבים כמודל בעלי חיים אידיאלי של רבייה אנושית.
Abstract
טכניקות הרבייה בסיוע (אמנויות), כגון תרבות העובר מחוץ לאדמה או קריוגנית העובר, להשפיע על דפוסי התפתחות טבעית עם השלכות לאחר הלידה ולידה. כדי להבטיח את innocuousness של יישומי אמנות, מחקרים במודלים של בעלי חיים נחוצים. בנוסף, כצעד אחרון, מחקרי פיתוח העובר דורשים הערכה של היכולת שלהם לפתח צאצאים בריאים לטווח מלא. כאן, העברת העובר אל הרחם הוא הכרחי לבצע כל ניסוי הקשורות לאומנויות.
הארנב שימש כאורגניזם מודל לחקר הרבייה של היונקים במשך יותר ממאה שנה. בנוסף הקרבה פילוגנטי שלו למין האנושי הגודל הקטן שלה ועלות תחזוקה נמוכה, יש לו מאפיינים הרבייה חשוב כגון ביוץ המושרה, כרונולוגיה של התפתחות עובריים מוקדם דומה לבני אדם הריון קצר המאפשרים לנו ללמוד את ההשלכות של יישום האמנות בקלות. יתר על כן, אמנויות (כגון הזרקת זרע תאיים, העובר תרבות, או הקפאה) מוחלים עם יעילות מתאימה במין הזה.
השימוש בטכניקת המעבר לפרוסקופי ובפרוטוקול הקריוגנית המוצג במאמר זה, אנו מתארים 1) כיצד להעביר עוברים דרך טכניקה קלה, פולשנית ומינימלית ו -2, פרוטוקול אפקטיבי לאחסון לטווח ארוך של ארנבים עוברים לספק יכולות לוגיסטיות זמן גמישות ויכולת להעביר את המדגם. התוצאות שהתקבלו לאחר העברת עוברי ארנבים בשלבים התפתחותיים שונים מצביעים על כך morula הוא השלב האידיאלי עבור התאוששות העובר הארנב והעברה. לפיכך, נדרשת העברה של עובר האובידיוס, המצדיקים את ההליך הכירורגי. יתר על כן, הארנב מורולאי בהצלחה מועברים והועבר לפרואו, ומוכיחים את האפקטיביות של הטכניקות המתוארות.
Introduction
עם מטרות של עקיפת פוריות האדם או שיפור הפצת בעלי חיים של ערך גנטי גבוה ושמירה על משאבים גנטיים בעלי חיים, סט של טכניקות שנקרא באופן קולקטיבי טכנולוגיות רבייה, כגון סופר ביוץ, ב הפריה חוץ גופית , תרבות העובר, או הקפאה,פותחו 1,2. כיום, מקבלים טיפולים הורמונליים כדי לעורר את השחלות ולייצר מספר רב של זקיקי השחלות העאליים1. Oocytes שנאסף מזקיקי אלה יכול להיות התבגר, מופרית, ופיתח בתוך מבחנה עד שהם הקפאה או הועבר אמהות פונדקאית3. עם זאת, במהלך טיפולים אלה, המשחק והזיטים חשופים לסדרה של תהליכים לא פיזיולוגיים שיכולים לדרוש הסתגלות העובר כדי לשרוד בתנאים אלה4,5. הסתגלות זו אפשרית עקב הפלסטיות המוקדמת של העובר, המאפשר שינויי העובר בביטוי הגנים ובתכנות התפתחותי6. עם זאת, שינויים אלה יכולים להשפיע על השלבים הבאים של התפתחות העובר עד לבגרות, ועכשיו הוא מקובל באופן נרחב כי שיטות, תזמון, הליך הקפאה או תנאי תרבות להראות תוצאות שונות על גורל העובר7 , 8. לכן, כדי להבהיר את ההשפעות הנובעות של אומנויות, השימוש במודלים של בעלי חיים מאופיין הוא בלתי נמנע.
הלידה הראשונה שתועדה כתוצאה מהעברת עוברי יונקים התקיימה ב-18909. היום, העברת העובר (ET) לנקבה פונדקאית היא צעד מכריע בלימוד השפעות האמנות המושרה במהלך טרום ההשתלה על שלבים לפיתוח העובר הבאים10. טכניקות ET תלויות בגודל ובמבנה האנטומי של כל חיה. במקרה של דגמים גדולים של בעלי חיים, זה היה אפשרי לבצע ET על ידי שיטות ET שאינן כירורגית, אבל בגודל קטן יותר צנתור מיני של צוואר הרחם הוא מורכב יותר טכניקות כירורגי משמשות לעתים קרובות11. עם זאת, ET כירורגית יכול לגרום לדימום שעלול לפגוע השרשה והתפתחות העובר, כמו דם יכול לפלוש לומן הרחם, גרימת מוות העובר10. שיטות שאינן כירורגיות ו-ET מיושמים עדיין בבני אדם, בבונים, שור, חזירים ועכברים12,13,14,15,16,17, אבל כירורגי מינים אלה עדיין נמצאים בשימוש במינים כגון עיזים, כבשים או בעלי חיים אחרים אשר מציגים קשיים נוספים10,18,19,20,21, כגון ארנבים (שניים קרוקס עצמאיים) או עכברים (בגודל קטן). עם זאת, שיטות העברה כירורגית נוטים להיות הוחלף בהדרגה על ידי שיטות פחות פולשנית. אנדוסקופיה שימש להעברת עוברים, למשל, בארנבים, חזירים ומעלי גירה קטנים18,19,20. אלה שיטות מינימלית פולשנית אנדוסקופיה ניתן להשתמש כדי להעביר עוברים אל ampulla באמצעות infundibulum, אשר חיוני ארנבים הפגינו השפעות מועילות במינים מסוימים20. הדבר מתבסס על חשיבות הדיאלוג הנכון בין העובר לבין האם בשלבי העובר המוקדמים בתעלת ההטלה. כפי שהוזכר לעיל, שיפוץ העובר המתרחשים בארנבים במהלך העברת העובר דרך תעלת ההטלה חיונית להשגת עוברים המסוגלים להשתיל22,23.
מודלים בעלי חיים גדולים יותר, כגון שור, מעניינים משום שהתכונות הביוכימי והשהשתלה דומות לאלה שבמין האנושי24. עם זאת, בעלי חיים גדולים הם יקרים מדי לשימוש בניסויים ראשוניים, ומכרסמים נחשבים מודל אידיאלי (76% אורגניזמים מודל הם מכרסמים) למחקר מעבדה25. עם זאת, מודל הארנב מספק כמה יתרונות על פני מכרסמים בלימודי הרבייה, כמו כמה תהליכים ביולוגיים הרבייה על ידי בני אדם דומים יותר ארנבים מאשר אלה בעכברים. האדם והארנבים להציג הפעלה דומה כרונולוגי הגנום העובריים, מבנה השליה והמניפולציה. בנוסף, שימוש בארנבים ניתן לדעת את העיתוי המדויק של הפריה ושלבי היריון בשל הביוץ המושרה25. מחזורי חיים בארנבות קצרים, השלמת ההריון במשך 31 ימים והגיעו לבגרות בסביבות 4-5 חודשים; החיה קלה לטיפול בשל התנהגותו הצייתנים והלא-אגרסיבית, והאחזקה שלה חסכונית מאוד בהשוואה להוצאות של בעלי חיים גדולים יותר. כמו-כן, חשוב לציין שבארנבים יש רחם דופלקס עם שני cervixes עצמאיים11,25. זה מציב את הארנב בעמדה מועדף, כמו עוברים מן הקבוצות הנסיוניות השונות ניתן להעביר לאותה חיה, אבל לתוך קרן רחם אחרת. זה מאפשר לנו להשוות בין ההשפעות הנסיוניות, הפחתת הגורם האימהי מהתוצאות.
כיום, לא כירורגי שיטות ET אינם בשימוש ארנב. מחקרים מסוימים שבוצעו בסוף שנות ה-90 באמצעות טכניקת העברת הדואר הביאו לשיעורי משלוח נמוכים החל מ-5.5% עד 20.0%11,26 לעומת 50-65% בשיטות כירורגיות, ביניהן הליך הלפרוסקופיה המתואר על ידי בסננפלדר וברים18. שיעורי ההצלחה הנמוכים של שיטות ET אלה שאינם כירורגיים בארנבים חופפים עם חוסר שיפוץ העובר הדרוש בתעלת ההטלה, אשר נמנעת במהלך הניתוח. כאן, אנו מתארים הליך אפקטיבי מינימלית לפרוסקופי ET באמצעות ארנבים כאורגניזם מודל. טכניקה זו מספקת מודל לחקר הרבייה נוסף בבעלי חיים גדולים ובבני אדם.
מכיוון שלארנבים יש חלון זמן צר במיוחד להשרשת העובר, ET במין זה מחייב מידה גבוהה של סנכרון בין השלב ההתפתחותי של העובר ב-ET והמצב הפיזיולוגי של הנמען27. במקרים מסוימים, לאחר טיפול הרבייה המאט את התפתחות העובר (כגון בתרבות מבחנה ) או משנה את הקבלה של רירית הרחם (כגון טיפולים ביוץ), אין סנכרון בין העובר והרחם האימהי. מצבים אלה יכולים להשפיע לרעה על התוצאה. כדי להגיב בהקשרים אלה, אנו מתארים ויטריפיקציה הארנב יעיל מורולה הפרוטוקול המאפשר לנו להשהות, לארגן ולחדש את הניסויים. תהליך זה הוא באופטימיות רצוי ללימודי הרבייה ונותן לנו את היכולת לאחסון לטווח ארוך של עוברים, המאפשר הובלה שלהם. הליך הלפרוסקופי ואסטרטגיות הקריוסקופיות מאפשרים תכנון טוב יותר של מחקרים עם פחות בעלי חיים. לפיכך, המתודולוגיה שלנו מציעה יתרונות היגיוניים וכלכליים ומתאימים לקונספט של שלושה ר’ (החלפה, הפחתה ועידון) של מחקר בעלי חיים במטרה לשפר את הטיפול האנושי בבעלי חיים ניסיוניים. כך, עם שיטות אלה, הארנבים מהווים אורגניזם מודל אידיאלי עבור vivo הרבייה .
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז המתועד הראשון של מקרה הלידה החיה מעוברים הועברו9, טכניקה זו ומינים הארנב הפכו קריטיים בלימודי הרבייה. חוץ מזה, מחקרי מחקר עובר מעורבים, ייצור, הקפאה, וכו ‘ דורשים כצעד האחרון הערכה של יכולת העובר ליצור צאצאים בריאים לטווח מלא. לכן, טכניקת העברת העובר היא הכרחית<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי כספים ממשרד הכלכלה והתחרותיות של ספרד (AGL2017-85162-C2-1-R) ו הכלטאת ולנסיה תוכנית מחקר (PrometeoII 2014/036). גרסת טקסט באנגלית שתוקנה על-ידי נ. מאקאן שירות לשפות אנגלית
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV – technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV – technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV – technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
References
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos?. Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
