Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Summary

Assisted reproductieve technieken (ARTs) worden voortdurend geëvalueerd om de resultaten te verbeteren en de daaraan verbonden Risico’s te verminderen. Dit manuscript beschrijft een minimaal invasieve embryotransfer procedure met een efficiënt cryopreservatie protocol dat het gebruik van konijnen als een ideaal dierlijk model van menselijke voortplanting toelaat.

Abstract

Geassisteerde reproductieve technieken (kunst), zoals in vitro embryocultuur of embryo cryopreservatie, beïnvloeden natuurlijke ontwikkelingspatronen met perinatale en postnatale gevolgen. Om de onschadelijkheid van kunst toepassingen te waarborgen, zijn studies in dierlijke modellen noodzakelijk. Bovendien, als een laatste stap, embryo ontwikkeling studies vereisen evaluatie van hun vermogen om op volledige termijn gezonde nakomelingen te ontwikkelen. Hier, embryotransfer naar de baarmoeder is onmisbaar voor het uitvoeren van een ARTs-gerelateerde experiment.

Het konijn is gebruikt als een modelorganisme om de voortplanting van zoogdieren te bestuderen voor meer dan een eeuw. In aanvulling op haar verwantschap nabijheid van de menselijke soort en de geringe omvang en lage onderhoudskosten, het heeft belangrijke reproductieve kenmerken zoals geïnduceerde ovulatie, een chronologie van de vroege embryonale ontwikkeling vergelijkbaar met de mens en een korte dracht die ons toelaten om de gevolgen van de kunst toepassing gemakkelijk te bestuderen. Bovendien worden kunst (zoals intracytoplasmatische spermainjectie, embryocultuur, of cryopreservatie) toegepast met geschikte efficiency in deze soort.

Met behulp van de laparoscopische embryotransfer techniek en de cryopreservatie protocol gepresenteerd in dit artikel, beschrijven we 1) hoe embryo’s overdracht door middel van een eenvoudige, minimaal invasieve techniek en 2) een effectief protocol voor de lange termijn opslag van konijn embryo’s om tijd-flexibele logistieke capaciteiten te bieden en de mogelijkheid om het monster te vervoeren. De resultaten verkregen na de overdracht van konijn embryo’s in verschillende ontwikkelingsstadia geven aan dat morula is de ideale fase voor konijn embryo herstel en overdracht. Zo is een oviductal embryotransfer vereist, rechtvaardigen de chirurgische procedure. Bovendien, konijn morulae zijn met succes verglaasd en Laparoscopisch overgedragen, waaruit de effectiviteit van de beschreven technieken.

Introduction

Met de doelstellingen van het omzeilen van menselijke onvruchtbaarheid of de verbetering van de verspreiding van vee van hoge genetische waarde en het behoud van dierlijke genetische hulpbronnen, een reeks technieken gezamenlijk genoemd ondersteunde reproductie technologieën, zoals superovulatie, in vitro fertilisatie, embryocultuur, of cryopreservatie, werden ontwikkeld^1,2. Momenteel worden hormonale behandelingen gegeven aan de eierstokken te stimuleren en produceren een groot aantal antral ovariële follikels¹. Oöcyten verzameld uit deze follikels kunnen worden gerijpt, bevrucht, en ontwikkeld in vitro totdat ze ofwel gecryopreserveerde of overgedragen aan surrogaat moeders³. Echter, tijdens deze behandelingen, gameten en zygoten worden blootgesteld aan een reeks van niet-fysiologische processen die kunnen vereisen embryo aanpassing om te overleven in deze omstandigheden^4,5. Deze aanpassing is mogelijk door de vroege embryo-plasticiteit, waardoor embryo veranderingen in genexpressie en ontwikkelings programmering⁶. Echter, deze wijzigingen kunnen invloed hebben op de daaropvolgende stadia van de ontwikkeling van embryo’s tot volwassenheid, en het is nu algemeen aanvaard dat methoden, timing, cryopreservatie procedure of cultuur voorwaarden tonen verschillende resultaten op embryo Fate^{7 , 8}. Daarom is het gebruik van goed gekenmerkte diermodellen onvermijdelijk om de specifieke geïnduceerde effecten van kunst te verhelderen.

De eerste gedocumenteerde levende geboorte als gevolg van de overdracht van zoogdier embryo’s vond plaats in 1890⁹. Vandaag, embryotransfer (ET) naar een surrogaat vrouwtje is een cruciale stap in het bestuderen van de kunst-geïnduceerde effecten tijdens de pre-implantatie op de daaropvolgende embryo ontwikkeling stadia¹⁰. ET de technieken hangen van de grootte en de anatomische structuur van elk dier af. In het geval van grote dierlijke modellen, is het mogelijk geweest om ET door transcervicale niet-chirurgische ET technieken uit te voeren, maar in kleiner-grootte soorten katheterisatie van de cervix is complexer en de chirurgische technieken worden vaak gebruikt¹¹. Echter, chirurgische ET kan leiden tot bloedingen die implantatie en embryo ontwikkeling kunnen schaden, als het bloed kan binnenvallen de baarmoeder lumen, waardoor embryo Death¹⁰. Transcervicale niet-chirurgische et technieken worden nog steeds toegepast bij mensen, bavianen, runderen, varkens en muizen^{12,13,14,15,16,17}, maar chirurgische ETS worden nog steeds gebruikt in soorten zoals geiten, schapen of andere dieren die extra moeilijkheden veroorzaken^{10,18,19,20,21}, zoals konijnen (twee onafhankelijke cervices) of muizen (kleine grootte). Niettemin, chirurgische overdracht methoden hebben de neiging geleidelijk te zijn vervangen door minder invasieve methoden. Endoscopie werd gebruikt voor de overdracht van embryo’s, bijvoorbeeld bij konijnen, varkens en kleine herkauwers^18,19,20. Deze minimaal invasieve endoscopie methoden kunnen worden gebruikt voor de overdracht van embryo’s in de ampulla via de infundibulum, die essentieel is bij konijnen en heeft aangetoond gunstige effecten in sommige soorten²⁰. Dit is gebaseerd op het belang van de juiste dialoog tussen embryo en moeder tijdens vroege embryonale stadia in de eileider. Zoals hierboven vermeld, het embryo remodeling dat plaatsvindt in konijnen tijdens de embryo migratie door de eileider is van essentieel belang voor het bereiken van embryo’s kunnen inplanteren^22,23.

Grotere dierlijke modellen, zoals runderen, zijn interessant, omdat de biochemische en pre-implantatie functies zijn vergelijkbaar met die in de menselijke soort²⁴. Nochtans, zijn de grote dieren te duur om in inleidende proeven te gebruiken, en de knaagdieren worden beschouwd als een ideaal model (76% modelorganismen zijn knaagdieren) voor laboratoriumonderzoek²⁵. Niettemin, het konijn model biedt een aantal voordelen ten opzichte van knaagdieren in reproductieve studies, zoals sommige reproductieve biologische processen tentoongesteld door de mens zijn meer vergelijkbaar in konijnen dan die in muizen. De mens en de konijnen presenteren een gelijkaardige chronologische embryonale genoom activering, gastrulation en hemochorial placenta structuur. Bovendien is het gebruiken van konijnen het mogelijk om de nauwkeurige timing van bemesting en zwangerschapsstadia te kennen toe te schrijven aan hun veroorzaakte ovulatie²⁵. Konijn levenscycli zijn kort, de voltooiing van de zwangerschap in 31 dagen en het bereiken van de puberteit op ongeveer 4-5 maanden; het dier is gemakkelijk te hanteren vanwege zijn volgzaam en niet-agressief gedrag, en het onderhoud is zeer zuinig in vergelijking met de kosten van grotere dieren. Bovendien is het van cruciaal belang te vermelden dat konijnen hebben een duplex baarmoeder met twee onafhankelijke baarmoederhals^11,25. Dit plaatst het konijn in een preferentiële positie, aangezien de embryo’s van de verschillende experimentele groepen in het zelfde dier, maar in een verschillende baarmoeder hoorn kunnen worden overgebracht. Dit stelt ons in staat om zowel experimentele effecten te vergelijken, het verminderen van de moeder factor van de resultaten.

Vandaag, niet-chirurgische ET methoden zijn niet in gebruik in konijn. Sommige studies uitgevoerd in de late jaren ‘ 90 met behulp van een transcervicale et techniek resulteerde in lage leverings percentages variërend van 5,5% tot 20,0%^11,26 versus 50-65% door chirurgische methoden, waaronder de laparoscopie procedure beschreven door Besenfelder en brem¹⁸. De lage slaagpercentages van deze niet-chirurgische ET methoden in konijnen samenvallen met het ontbreken van de noodzakelijke embryo remodeling in de eileider, die wordt vermeden in transcervicale ET. Hier beschrijven we een effectieve minimaal invasieve laparoscopische ET procedure met behulp van konijnen als een modelorganisme. Deze techniek biedt een model voor verder voortplantings onderzoek bij grote dieren en mensen.

Omdat de konijnen een bijzonder smal tijdvenster voor embryo implantatie hebben, vereist ET in deze soort een hoge graad van synchronie tussen de ontwikkelingsfase van het embryo in ET en de fysiologische status van de ontvanger²⁷. In sommige gevallen, na een reproductieve behandeling die embryo ontwikkeling (zoals in vitro cultuur) vertraagt of het endometrium ontvankelijkheid (zoals superovulatie behandelingen) verandert, is er geen synchronie tussen het embryo en de moeder baarmoeder. Deze situaties kunnen een negatieve invloed hebben op het resultaat. Om te reageren in deze context, beschrijven we een effectief konijn morula verglazing protocol dat ons in staat stelt te pauzeren, organiseren en hervatten van de experimenten. Dit proces is logistiek wenselijk voor reproductieve studies en geeft ons de capaciteit voor lange termijn opslag van embryo’s, waardoor hun vervoer. De laparoscopische procedure en cryopreservatie strategieën zorgen voor een betere planning van studies met minder dieren. Onze methodologie biedt dus hygiënische en economische voordelen en voldoet aan het concept van de 3V (vervanging, reductie en verfijning) van dier onderzoek met als doel de menselijke behandeling van proefdieren te verbeteren. Aldus, met deze methodes, vormen de konijnen een ideaal modelorganisme voor in vivo reproductieve analyses.

Protocol

Alle in deze studie gebruikte experimentele procedures werden uitgevoerd overeenkomstig richtlijn 2010/63/EU-EEG voor dierproeven en werden door het ethische Comité voor experimenten met dieren van de Universitat Politècnica de València beoordeeld en goedgekeurd. Spanje (onderzoek code: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC en JSV heeft een autorisatie certificaat afgegeven door de regering van Valencia om te experimenteren op dieren. XGD is gemachtigd om in situ toezicht te houden op het welzijn en de verzorging van de…

Representative Results

Minimaal invasieve laparoscopische overdracht van verse of verglaasd embryo’s plaatst het konijn onder de beste modeldieren voor reproductieve studies. Tabel 1 toont de resultaten van Fresh et in verschillende ontwikkelingsstadia (Figuur 4) van overgebrachte embryo’s. De overlevingskans bij de geboorte (percentage van de embryo’s die resulteren in een pup) bleek de werkzaamheid van de laparoscopische techniek beschreven in dit document. De ho…

Discussion

Sinds het eerste gedocumenteerde levende geboorte geval van overgebrachte embryo’s⁹, zijn deze techniek en de konijn soorten essentieel in reproductieve studies geworden. Daarnaast vereisen embryo-onderzoek met manipulatie, productie, cryopreservatie, enz. , als laatste stap de evaluatie van de embryo capaciteit voor het opwekken van gezonde nakomelingen op volle termijn. Daarom is embryotransfer techniek onmisbaar^13,28. In de loo…

Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphine hydrochloride	Alvet Escartí	626	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buserelin Acetate	Sigma Aldrich	B3303
Clorhexidine digluconate soap	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Clorhexidine digluconate solution	Alvet Escartí	0265DCCA500B
CO2	Air Liquide	99921	CO2 N48.
CO2 Incubator	Fisher scientific	15385194
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	W387509
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D5773	Without calcium chloride.
Electric razor	Oster Golden A5	078005-140-002
Endoscope camera	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoscope trocar with silicone leaflet valve	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Lightweight trocar model.
Enrofloxacin	Alvet Escartí	9993046	To be ordered by a licensed veterinarian.
Epicraneal needle 23G	Alvet Escartí	514056353	Smaller needles can be also used.
Epidural catheter	Vygon corporate	187.10
Epidural needle	Vygon corporate	187.10
Ethylene Glycol	Sigma Aldrich	102466-M
Eye ointment	Alvet Escartí	5273
Ketamine hydrochloride	Alvet Escartí	184	To be ordered by a licensed veterinarian.
Laparoscopy equipment	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel.
Light source	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Liquid Nitrogen	Air Liquide	P1505XXX
Mechanical CO2 insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Meloxicam	Alvet Escartí	9993501	To be ordered by a licensed veterinarian.
Petri dishes, 35-mm	Sigma Aldrich	CLS430165-500EA
Plastic dressing (Nobecutan)	IBOR medica	7140028
Plastic Straw 0.25 mL	IMV – technologies	6431
Povidone iodide solution	Alvet Escartí	02656DPYS500S
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
Silicone tube for insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
Stereomicroscope	Leica	MZ16F	There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few.
Sterile Gloves	Alvet Escartí	087GL010075
Sterile gown	Alvet Escartí	12261501
Sterile mask	Alvet Escartí	058B15924B
Straw Plug	IMV – technologies	6431
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Syringe, 1-mL	Fisher scientific	11750425
Syringe, 5-mL	Fisher scientific	11773313
Urinary catheter	IMV – technologies	17722
Waterbath	RAYPA	BAE-4
Xylazine	Alvet Escartí	525225	To be ordered by a licensed veterinarian.
Rabbits	Universitat Politècnica de València	Line A	Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used.