Summary

समुद्र Lamprey Pheromones की पहचान परख का उपयोग-निर्देशित भिंन

Published: July 17, 2018
doi:

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल को अलग और संरचना, घ्राण शक्ति, और ख्यात फेरोमोन यौगिकों के सागर lampreys के व्यवहार प्रतिक्रिया की विशेषता प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

परख निर्देशित भिंन एक चलने दृष्टिकोण है कि शारीरिक और व्यवहार परख के परिणामों का उपयोग करता है अलगाव और एक सक्रिय फेरोमोन यौगिक की पहचान गाइड है । इस विधि रासायनिक संकेतों है कि पशु प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला में pheromones के रूप में कार्य के सफल लक्षण वर्णन में हुई है । सागर lampreys व्यवहार या शारीरिक प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता pheromones का पता लगाने के लिए olfaction पर निर्भर करते हैं । हम ख्यात pheromones के मंज़ूर कार्यों के लिए मछली जीवविज्ञान के इस ज्ञान का उपयोग करें और अलगाव और सक्रिय फेरोमोन घटकों की पहचान गाइड । क्रोमैटोग्राफी को निकालने, ध्यान केंद्रित करने, और वातानुकूलित पानी से अलग यौगिकों का प्रयोग किया जाता है । इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग का निर्धारण करने के लिए आयोजित की जाती हैं जो भिन्न घ्राण प्रतिसादों को बाहर लाना. दो विकल्प भूलभुलैया व्यवहार परख तो अगर कोई भी गंध अंश का यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है व्यवहार से सक्रिय है और एक वरीयता प्रेरित । Spectrometric और स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीके आणविक वजन और संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए संरचना elucidation के साथ सहायता करते हैं । शुद्ध यौगिकों की EOG और व्यवहार परख के साथ की पुष्टि की है । भूलभुलैया में मनाया व्यवहार प्रतिक्रियाओं अंततः एक प्राकृतिक स्ट्रीम सेटिंग में उनके समारोह की पुष्टि करने के लिए एक क्षेत्र की स्थापना में मान्य किया जाना चाहिए. इन परख 1 करने के लिए एक दोहरी भूमिका निभाते हैं) अंश प्रक्रिया गाइड और 2) की पुष्टि करें और आगे अलग घटकों की अधिकता को परिभाषित । यहां, हम एक समुद्र lamprey फेरोमोन पहचान के प्रतिनिधि परिणामों की रिपोर्ट है कि उदाहरण देना परख की उपयोगिता-निर्देशित भिंन दृष्टिकोण । समुद्र lamprey pheromones की पहचान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि इसकी फेरोमोन संचार प्रणाली का एक मॉडुलन Laurentian महान झीलों में इनवेसिव समुद्र lamprey को नियंत्रित करने के लिए विचार किया विकल्पों में से एक है । इस विधि को आसानी से taxa की एक व्यापक सरणी में रासायनिक संचार की विशेषताएं और जलजनित रासायनिक पारिस्थितिकी पर प्रकाश डाला अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

Pheromones विशिष्ट रासायनिक व्यक्तियों द्वारा जारी संकेत है कि उंहें खाद्य स्रोतों का पता लगाने में सहायता कर रहे हैं, शिकारियों की पहचान, और मध्यस्थता के सामाजिक बातचीत के विशिष्ट1। कीड़ों में फेरोमोन संचार अच्छी तरह से2अध्ययन किया गया है; हालांकि, जलीय हड्डीवाला pheromones की रासायनिक पहचान और जैविक कार्य के रूप में बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है । पहचान और pheromones के समारोह का ज्ञान जारी की धमकी दी प्रजातियों की वसूली की सुविधा के लिए लागू किया जा सकता है3,4 या नियंत्रण कीट प्रजातियों5,6। इन तकनीकों के आवेदन अलगाव और आवश्यक के लक्षण वर्णन सक्रिय फेरोमोन घटकों ।

फेरोमोन पहचान प्राकृतिक उत्पाद रसायन विज्ञान की एक शाखा है । फेरोमोन अनुसंधान में प्रगति आंशिक रूप से फेरोमोन अणुओं की प्रकृति के कारण खुद को सीमित किया गया है । Pheromones अक्सर अस्थिर और छोटी मात्रा में जारी कर रहे हैं, और केवल कुछ नमूना तकनीक अस्थिर7,8 या पानी में घुलनशील यौगिकों9की मिनट की मात्रा का पता लगाने के लिए मौजूद हैं । pheromones की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण शामिल 1) ज्ञात यौगिकों, 2) metabolomics के एक लक्षित स्क्रीनिंग, और 3) परख निर्देशित भिंन । ज्ञात यौगिकों की लक्षित स्क्रीनिंग pheromones के रूप में कार्य करने के लिए परिकल्पना शारीरिक प्रक्रियाओं के उत्पादों द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चयापचय परीक्षण । इस दृष्टिकोण क्योंकि शोधकर्ताओं केवल ज्ञात और उपलब्ध यौगिकों का परीक्षण कर सकते है सीमित है । हालांकि, यह सुनहरी में सेक्स हार्मोन की सफल पहचान के परिणामस्वरूप है कि pheromones10,11,12के रूप में कार्य करते हैं । Metabolomics एक दूसरी फेरोमोन पहचान दृष्टिकोण है कि एक जैविक प्रणाली13के भीतर संभावित छोटे अणु चयापचय उत्पादों को अलग है । दो समूहों के चयापचय प्रोफाइल की तुलना (यानी, एक सक्रिय बनाम एक निष्क्रिय निकालने) एक संभावित चयापचय प्रोफ़ाइल की पहचान है जिसमें से metabolite शुद्ध है सक्षम बनाता है, संरचना का आविर्भाव है, और 14की पुष्टि की है । विशिष्ट मिश्रण के जटिल योगों के Additive या synergistic प्रभाव अधिक metabolomics के साथ पता लगाया जा करने के लिए संभावना है क्योंकि चयापचयों एक साथ के बजाय भागों13की एक श्रृंखला के रूप में माना जाता है । फिर भी, metabolomics के कार्यांवयन सिंथेटिक संदर्भ की उपलब्धता पर निर्भर करता है क्योंकि परिणामी डेटा उपंयास संरचनाओं के elucidation की सुविधा नहीं है ।

परख-निर्देशित भिंन एक एकीकृत, चलने दृष्टिकोण है कि दो क्षेत्रों spans: रसायन विज्ञान और जीव विज्ञान है । इस दृष्टिकोण शारीरिक और व्यवहार परख के परिणाम के लिए अलगाव और एक सक्रिय फेरोमोन यौगिक की पहचान गाइड का उपयोग करता है । एक कच्चे तेल निकालने एक रासायनिक संपत्ति (यानी, आणविक आकार, ध्रुवीकरण, आदि) और इलेक्ट्रो-olfactogram (EOG) रिकॉर्डिंग और के साथ परीक्षण द्वारा fractionated है/ विक्रियाशील घटकों को भिन्नीकरण और EOGs के इन कदमों को दोहराने से दिखलाई पड़ जाती है और/ शुद्ध सक्रिय यौगिकों की संरचनाओं spectrometric और स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों, जो आणविक वजन और संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए यौगिक का एक खाका संश्लेषित किया जा उत्पादन के द्वारा आविर्भाव होते हैं । परख निर्देशित भिन्नीकरण अद्वितीय रासायनिक कंकाल है कि जैव सिंथेटिक रास्ते से भविष्यवाणी की जाने की संभावना नहीं है के साथ विविध चयापचयों और संभावित उपंयास pheromones उपज कर सकते हैं ।

यहां, हम परख निर्देशित भिन्नीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए अलग और पुरुष समुद्र lamprey सेक्स फेरोमोन यौगिकों की गैर-सक्रियता विशेषताएं । समुद्र lamprey (Petromyzon marinus) फेरोमोन संचार का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श हड्डीवाला मॉडल है क्योंकि इन मछलियों रासायनिक cues के घ्राण का पता लगाने पर भारी भरोसा करने के लिए अपने anadromous जीवन तीन अलग चरणों के शामिल इतिहास मध्यस्थता: लार्वा, जुवेनाइल, और वयस्क । समुद्र lamprey लार्वा मीठे पानी धाराओं की तलछट में चिपमंक, एक कठोर कायापलट से गुजरना, और वे बड़े मेजबान मछली परजीवी जहां एक झील या महासागर के लिए पलायन कि किशोरों में बदलना । मेजबान मछली से अलग करने के बाद, वयस्कों वापस नदियों में स्थानांतरित, प्रवासी धारा द्वारा जारी pheromones द्वारा निर्देशित-निवासी लार्वा15,16,17,18,19 . परिपक्व पुरुषों को पैदा करने के आधार पर चढ़ना, एक बहु घटक सेक्स फेरोमोन साथियों को आकर्षित करने के लिए, पड़े लगभग एक सप्ताह के लिए अंडे, और फिर मरने15,20। समुद्र lamprey pheromones की पहचान महत्वपूर्ण है क्योंकि फेरोमोन संचार प्रणाली का एक मॉडुलन Laurentian ग्रेट झील21में इनवेसिव समुद्र lampreys को नियंत्रित करने के लिए माना जाता विकल्पों में से एक है ।

Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के उपयोग समिति (AUF # 03/14-054-00 और 02/17-031-00) द्वारा अनुमोदित किया गया है । 1. संग्रह और समुद्र Lamprey वातानुकूलित पानी की निकासी व?…

Representative Results

परख-निर्देशित भिन्नीकरण के प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का सारांश आरेख 1 चित्रामें दिखाया गया है. प्रोटोकॉल को अलग और संरचना, घ्राण शक्ति, और 5 ख्यात सागर lamprey pheromones (चित्रा 2</stron…

Discussion

मछली एक रासायनिक यौगिकों से भरा अभी तक की पहचान की दुनिया में रहते हैं । परख निर्देशित भिन्नीकरण की पहचान करने के लिए आवश्यक साबित कर दिया है और जैव सक्रिय अणुओं है कि मध्यस्थता कई रासायनिक बातचीत की वि…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम अपने अनुसंधान सुविधाओं के उपयोग के लिए अमेरिका भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण हैमंड बे जैविक स्टेशन धंयवाद और अमेरिका मछली और वंय जीव सेवा और मत्स्य पालन और महासागरों कनाडा सागर lampreys प्रदान करने के लिए के कर्मचारियों के लिए । इस अनुसंधान Weiming ली और Ke li करने के लिए महान झीलों मत्स्य आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Premium standard wall borosilicate capillaries with filament  Warner Instruments G150F-4 recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument  Narishige PC-10 pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter Generic cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments ESP-M15N recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments E45P-F15NH reference electrode holder
1 mm pin Warner Instruments WC1-10 to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin Warner Instruments WC2-5 to bridge reference and recording electrode holders
Agar Sigma A1296 molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333 3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil World Precision Instruments MF28G-5 to fill electrodes and electrode holders 
L-Arginine Sigma A5006 positive control odorant for EOG
Methanol Sigma 34860
Water bath Custom made N/A holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) Syndel USA Tricaine1G EOG anesthetic 
Gallamine triethiodide Sigma G8134-5G EOG paralytic
1 mL syringe BD Biosciences 301025 to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8 BD Biosciences 305115 to administer paralytic
Roller clamp World Precision Instruments 14043-20 adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl) J.T. Baker 3624-05 for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage Custom made N/A holds lamprey during EOG
Plastic trough Custom made N/A holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades – #11 Fine Science Tools 10011-00 for EOG dissection
Scalpel Handle – #3 Fine Science Tools 10003-12 for EOG dissection
Straight ultra fine forceps Fine Science Tools 11252-00 for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps Fine Science Tools 11370-42 for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors Fine Science Tools 15003-08 for EOG dissection
Stereomicroscope Zeiss Discovery V8 for EOG dissection
Illuminator light Zeiss CL 1500 ECO for EOG dissection
Plastic tubing Generic to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing  Custom made N/A
In line filter and gasket set Lee Company TCFA1201035A
Micromanipulators Narishige MM-3 to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices Kanetec MB-K
Valve driver Arduino custom made to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve Lee Company LFAA1201618H valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier Digitimer Ltd. NL106 to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage Digitimer Ltd. NL102G to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter Digitimer Ltd. NL125
Digitizer Molecular Devices LLC Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software Molecular Devices LLC AxoScope version 10.4 
Faraday cage Custom made N/A Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze Custom made N/A waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump Honda WT30XK4A fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing Cole Parmer Masterflex 07557-00 to adminster odorants in maze
Inverter Generator  Honda EU1000i powers perstaltic pump
Release cage Custom made N/A used to acclimate lamprey in the maze
Mesh Generic used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon) Generic to mix odorants
Flow meter Marsh-McBirney Flo-Mate 2000 to measure discharge
XAD 7 HP resin Dow chemical 37380-43-1 for extraction of conditioned water 
Methanol Sigma 34860 for extraction of conditioned water 
Water bath Yamato BM 200 for extraction of conditioned water 
Freeze dryer Labconco CentriVap  Concentrator for extraction of conditioned water 
chloroform Sigma CX1050 for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates Sigma 99571 for isolation of fraction pools
anisaldehyde Sigma A88107 for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20 GE Healthcare 17-0090-01 for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin Sigma XAD7HP for extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columns Ace Glass Inc. 5820 for extraction of conditioned water 
Acetone Sigma 650501 for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) Waters Co. N/A for structure elucidation
Binary HPLC pump Waters Co. 1525 for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) Agilent N/A for structure elucidation
Rotovap drying system Buchi RII for extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm) Spectronics Co. ENF-240C for thin layer chromatography 

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Cite This Article
Scott, A. M., Li, K., Li, W. The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation. J. Vis. Exp. (137), e58059, doi:10.3791/58059 (2018).

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