Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography
Summary
Wire myograph tekniken används för att undersöka vaskulär glatt muskulatur funktioner och skärmen nya droger. Vi rapporterar en detaljerade protokoll för mätning av isometrisk kontraktilitet av mus mesenterica artär och för screening nya muskelavslappnande medel i vaskulär glatt muskulatur.
Abstract
Wire myograph tekniken används för att bedöma kontraktiliteten i vaskulära glatta muskulaturen i svar till depolarisering, GPCR agonister/hämmare och droger. Det är allmänt används i många studier på de fysiologiska funktionerna i vaskulär glatt muskulatur, patogenesen av vaskulära sjukdomar som hypertoni och utvecklingen av glatt muskulatur muskelavslappnande läkemedel. Musen är en allmänt använd modell djur med en stor pool av sjukdomsmodeller och genetiskt modifierade stammar. Vi introducerade denna metod för att mäta isometrisk sammandragning av mus mesenterica artär i detalj. En 1,4-mm segment av mus mesenterica motstånd artär isolerades och monterad på en myograph kammare genom att passera två ståltråd genom dess lumen. Efter Jämviktstiden och normalisering steg, var fartyget segmentet förstärkte av en hög-K+ lösningen två gånger före sammandragning analysen. Som ett exempel på tillämpning av denna metod i läkemedelsutveckling mätte vi den relaxerande effekten av en roman naturlig substans, neoliensinine, isolerade från en kinesisk ört, embryon av lotus utsäde (Nelumbo nucifera Gaertn.) på mus mesenterica artärer. De fartygssegment som är monterad på myograph kammaren stimuleras med en hög-K+ lösning. När kraft spänningen nått en stabil varaktig fas, har kumulativa doser av neoliensinine lagts till i kammaren. Vi fann att neoliensinine hade en dosberoende relaxerande effekt på glatt muskulatur kontraktion, vilket tyder på att det bär potentiella aktivitet mot hypertoni. Dessutom segmentet fartyg kan överleva minst 4 timmar efter montering och underhåll kontraktilitet som induceras av hög-K+ lösningen för många gånger, vi föreslår att kan tråd myograph systemet användas för tidskrävande processen för drogkontroll.
Introduction
Små fartyg myograph systemet används här var för att mäta isometrisk sammandragning av litet motstånd fartyg med interna diametrar, från 100 till 400 µm. isolerade små fartyg (ca 2 mm lång) infördes genom två 40 µm diameter sladdar och var sedan monterad på mikrometer-sida och givare-sida käftarna sekventiellt. Denna myograph teknik först föreslogs i 19721 och sedan utvecklas främst genom Mulvany och hans kollegor2,3,4,5,6. Det är nu en mogen teknik med stabil utrustning, lätt prestanda och en standard normalisering förfarande7,8,9. Vi utnyttjade denna metod med några ändringar för mätningar i den mus mesenterica artären.
Vaskulär glatt muskulatur linjer väggarna i nästan alla blodkärl. Deras grundläggande funktion är att generera styrkor genom kontraktion som svar på olika stimuli. Den normala kontraktiliteten av vaskulär glatt muskulatur är viktigt för blodtrycket förordning och nutrition kompletterar10. Onormal reglering av blodtryck resulterar i en mängd olika sjukdomar, inklusive högt blodtryck, hjärtsvikt och ischemi. Flera studier har föreslagit att onormalt blodtryck alltid är associerade med dysfunktionella vaskulär glatt muskulatur kontraktilitet7,11,12,13. Den myograph metoden tillåter utredning av isometrisk kontraktilitet av mus fartyg inducerad av olika stimuli inklusive vasoconstrictors, -hämmare och läkemedel. Lyckade mätningar av kontraktion hjälper oss att förstå mekanismerna bakom blodtryck underhåll och patogenesen av vaskulär glatt muskulatur-associerade sjukdomar och att utforska nya terapeutiska metoder.
Många kinesiska örter har använts i stor utsträckning för klinisk behandling av vaskulära sjukdomar; deras effektiva ingredienser dock brukar okänd. Således, isolering och identifiering av effektiva komponenterna är mycket viktig för utvecklingen av nya läkemedel. Multi wire myograph teknik erbjuder en enkel metod för screening aktiva komponenter i örter. Vi har rapporterats flera studier med hjälp av små fartyg myograph systemet för att undersöka mus mesenterica artär kontraktion och identifierat naturliga föreningar med anti hypertoni aktivitet12,13,14. Här beskriver vi de detaljerade protokoll för metoden myograph och bedöma den relaxerande effekten av neoliensinine isolerade från embryon av lotus utsäde (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hypertoni är en utbredd folkhälsa utmaning på grund av dess allvarliga komplikationer, inklusive hjärt- och njur sjukdomar16. Förstå patogenesen vid hypertoni och utforska mer blodtryckssänkande läkemedel har blivit en brådskande uppgift i det här fältet. Blodtryck skapas och underhålls av perifer resistens av cirkulationen. Enligt Poiseuilles lag, relativt små artärerna genererar en stor del av cirkulatorisk motstånd och fungera som den dominerande tillverkaren av blodtryck<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Wei Qi He (Soochow universitet, Suzhou, Kina) och Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi’an, Kina) för tekniskt bistånd. Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (Grant 31272311, 81373295 och 81473420) och de projekt finansierat av prioriterade akademiska Program utveckling av Jiangsu högskolorna (Grant nr. ysxk-2016).
Materials
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
References
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. . Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. . Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
