I denne artikel vil give vi en detaljeret protokol for udtryk for fluorescerende fusion proteiner i murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager. Metoden er baseret på transduktion af knoglemarv stamceller med retroviral konstruktioner efterfulgt af differentiering af makrofager og dendritiske celler i vitro.
Dendritiske celler og makrofager er afgørende celler, der danner den første linje i forsvar mod patogener. De også spille en vigtig rolle i iværksættelsen af en adaptiv immunrespons. Eksperimentelt arbejde med disse celler er temmelig udfordrende. Deres overflod i organer og væv er relativt lavt. Som et resultat, kan ikke de være isoleret i stort tal. De er også svært at transfect med cDNA konstruktioner. I murine modellen, kan disse problemer løses delvist af in vitro- differentiering fra knoglemarven stamfaderen M-CSF for makrofager eller GM-CSF for dendritiske celler. På denne måde er det muligt at opnå store mængder af disse celler fra meget få dyr. Derudover kan knoglemarv stamceller være transduced med retroviral vektorer transporterer cDNA konstruktioner i tidlige stadier af dyrkning før deres differentiering i knoglemarven afledt dendritiske celler og makrofager. Retroviral transduktion efterfulgt af differentiering i vitro kan således bruges til at udtrykke forskellige cDNA konstruktioner i disse celler. Evnen til at udtrykke ektopisk proteiner betydeligt udvider rækken af eksperimenter, der kan udføres på disse celler, herunder levende celle billeddannelse af fluorescerende proteiner, tandem purifications interactome analyser, struktur-funktion analyser, overvågning af cellulære funktioner med biosensorer og mange andre. I denne artikel vil beskrive vi en detaljeret protokol til retroviral transduktion af murine knoglemarv afledt dendritiske celler og makrofager med vektorer, der koder for fluorescently markeret proteiner. På eksemplet med to adapter proteiner, OPAL1 og PSTPIP2, vise vi sin praktiske anvendelse i flowcytometri og mikroskopi. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved denne fremgangsmåde.
Myeloide celler udgør en uundværlig del af vores forsvarsmekanismer mod patogener. De er i stand til hurtigt fjerne mikrober, samt døende celler. Derudover er de også involveret i regulering af udvikling af væv og reparation og opretholde homeostase1,2,3. Alle myeloide celler differentiere fra fælles myeloide stamceller i knoglemarven. Deres differentiering i mange funktionelt og morfologisk særskilt undersæt er i vid udstrækning kontrolleret af cytokiner og deres forskellige kombinationer af4. De mest intensivt undersøgt myeloide celle subsets omfatter neutrophilic granulocytter, makrofager og dendritiske celler. Fejl i nogen af disse befolkningsgrupper føre til potentielt livstruende konsekvenser og forårsage alvorlige dysfunktioner af immunsystemet hos mennesker og mus1,2,3,5, 6.
I modsætning til neutrophilic granulocytter, dendritiske celler og makrofager er bosiddende celler, væv og deres overflod i immun organer er relativt lavt. Som et resultat, er isolering og oprensning af primære dendritiske celler og makrofager for eksperimenter der kræver et stort antal af disse celler dyre og ofte umuligt. For at løse dette problem, er protokoller blevet udviklet for at opnå store mængder af homogen makrofager og dendritiske celler in vitro. Disse tilgange er baseret på differentiering af murine knoglemarv celler i overværelse af cytokiner: makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) til makrofager og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) eller Flt3 ligand for dendritiske celler7,8,9,10,11,12. Celler genereret af denne metode er almindeligt beskrevet i litteraturen som knoglemarven afledt makrofager (BMDMs) og knoglemarv afledt dendritiske celler (BMDCs). De har flere fysiologiske egenskaber primære makrofager og dendritiske celler end med tilsvarende cellelinjer. En anden stor fordel er muligheden for at opnå disse celler form genetisk modificerede mus13. Sammenlignende studier mellem wild-type celler og celler, der stammer fra genmodificerede mus er ofte afgørende for afsløring roman funktioner af gener eller proteiner af interesse.
Analyse af subcellulært lokalisering af proteiner i levende celler kræver kobling af en fluorescerende etiket til protein af interesse i vivo. Dette sker oftest ved at udtrykke genetisk kodet fusion konstruktion består af en analyseret protein koblet (ofte via en kort linker) til en fluorescerende proteiner (fx., grøn fluorescerende proteiner (NGL))14,15 , 16. udtrykket af fluorescently mærket proteiner i dendritiske celler eller makrofager er udfordrende. Disse celler er generelt vanskeligt at transfect af standard Transfektion procedurer og effektivitetsgevinsterne tendens til at være meget lav. Desuden, Transfektion er forbigående, det genererer cellulært stress og opnåede intensiteten af fluorescens kan ikke være tilstrækkeligt for mikroskopi17. For at opnå en rimelig brøkdel af disse celler med en tilstrækkelig grad af transgenet udtryk, infektion af knoglemarv stamceller med retroviral er vektorer og deres efterfølgende differentiering af BMDMs eller BMDCs blevet en meget effektiv tilgang. Det er tilladt for analyse af proteiner af myeloide oprindelse i deres native cellulære miljø, både i en stabil tilstand eller i processer, der er kritiske for immunrespons fagocytose, immunologiske synapse dannelse eller migration. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for stabile udtryk af fluorescently mærket proteiner af interesse i murine knoglemarv afledt makrofager og dendritiske celler.
Udtryk for protein af interesse i target-cellerne er et vigtigt skridt i mange typer af biologiske undersøgelser. Differentierede makrofager og dendritiske celler er vanskeligt at transfect af standard Transfektion og retroviral transduktion teknikker. Omgåelse Transfektion af disse differentierede celler med retroviral transduktion af knoglemarven progenitorceller, efterfulgt af differentiering, når de allerede bærer det ønskede konstruktion, er et kritisk skridt giver udtryk for ekstrauterin cDNAs i disse celletyp…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tjekkiske Science Foundation (GACR) (projektnummer 16-07425S), af Charles University Grant agentur (GAUK) (projektnummer 923116) og af institutionel finansiering fra Institut for molekylær genetik, Academy of Sciences i tjekkiske Republik (RVO 68378050).
DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |