マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現
Summary
この記事では骨髄での蛍光融合蛋白質の表現のための詳しいプロトコル由来樹状細胞とマクロファージを提供します。手法は骨髄の伝達レトロ ウイルス構造続いてマクロファージへの分化と樹状に前駆細胞の in vitro細胞します。
Abstract
樹状細胞やマクロファージは、病原体に対する防御の最初の行を形成する重要な細胞です。彼らはまた、適応免疫応答の開始に重要な役割を果たします。これらの細胞と実験的な作品はかなり困難です。彼らの豊富な臓器や組織には比較的低いです。その結果、彼らは大量に分離することはできません。また、cDNA の構造と transfect に困難です。マウス モデルにおけるこれらの問題は、M-CSF のマクロファージや樹状細胞に GM-CSF 存在下で骨髄前駆細胞から生体外で分化によって部分的に解決できます。この方法で非常に少数の動物から多量のこれらのセルを取得することが可能です。また、骨髄前駆細胞は、骨髄由来の樹状細胞とマクロファージに分化させ前に栽培の初期段階中に cDNA の構造を運ぶレトロ ウイルスのベクトルを使用導入できます。したがって、これらのセルのさまざまな cDNA の構造を表現するための in vitro分化続くレトロ ウイルスの伝達を使用できます。実質的に異所性の蛋白質を表現する能力は、蛍光タンパク質、タンデム精製インタラクトーム解析、構造機能解析のための生きているセルイメージ投射を含むこれらのセルに対して実行できる実験の範囲を拡張します。バイオ センサーおよび他の多くの細胞の機能を監視します。この記事では蛍光付けられた蛋白質のためのコーディングのベクトルとマウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージのレトロ ウイルスの伝達のための詳しいプロトコルについて説明します。OPAL1 と PSTPIP2、2 つのアダプター蛋白質の例には、フローサイトメトリーと顕微鏡でその実用的なアプリケーションを示します。利点とこのアプローチの限界についても述べる。
Introduction
骨髄系細胞は、病原体に対する私達の防衛メカニズムの不可欠な部分を表します。彼らは急速に死細胞と同様に、微生物を除去することができます。さらに、彼らは組織開発・修理調整や恒常性1,2,3を維持に関与しています。すべての骨髄細胞は骨髄で一般的な骨髄前駆細胞から区別します。多くの機能的および形態学的に明瞭なサブセットに分化させサイトカインとのさまざまな組み合わせの4によって制御される大規模な程度です。好中球の顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、最も集中的に調査の骨髄細胞のサブセットが含まれます。これらの集団のいずれかの欠陥は、潜在的に生命にかかわる結果とヒトとマウス1,2,3,5,の免疫システムの機能不全を深刻な原因につながる6。
異なり、好中球の顆粒は、樹状細胞やマクロファージ、組織細胞と免疫器官における生息が比較的低い。その結果、分離・精製主樹状細胞と多数のこれらのセルを必要とする実験のためマクロファージは高価で、多くの場合不可能です。この問題を解決するために大量の同種のマクロファージや樹状細胞の培養を取得するプロトコルが開発されています。これらのアプローチは、サイトカインの存在下での骨髄細胞の分化に基づいています: マクロファージ コロニー刺激因子 (M-CSF) マクロファージや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) の Flt3 リガンドの樹状細胞7,8,9,10、11,12。このメソッドによって生成された細胞は、骨髄由来マクロファージ (BMDMs) と骨髄由来樹状細胞 (黒谷) は、文献のとおり一般的です。彼らはプライマリ マクロファージまたは対応する細胞より樹状細胞と共通の生理学的プロパティがあります。もう一つの主要な利点は、遺伝子これらの細胞の形態を得る可能性変更マウス13です。野生型細胞間比較研究し、遺伝子改変マウス由来の細胞は、遺伝子の発見の新しい機能または興味の蛋白質のために重大。
生きている細胞の蛋白質の細胞内局在性の解析には、体内の興味の蛋白質に蛍光ラベルの結合が必要です。蛍光蛋白質に (多くの場合短いリンカー) を介して結合解析タンパク質から成る遺伝的コード化の融合構造を表現することにより、最も一般的これ (e.g、緑の蛍光蛋白質 (GFP))14,15 。,16. 樹状細胞やマクロファージの蛍光付けられた蛋白質の表現は難しい。これらの細胞は一般的に transfect に困難で標準的なトランスフェクション プロシージャによって、効率は非常に低い傾向にあります。また、遺伝子導入は一時的なもの、細胞ストレスを生成する、蛍光の強度を実現した顕微鏡17のためできない可能性があります。十分な骨髄前駆細胞にレトロ ウイルスの感染、遺伝子発現レベルでこれらの細胞の合理的な割合を得るためにベクトルと BMDMs や黒谷にそれに続く分化が非常に効率的ななっています。アプローチ。それは彼らのネイティブ セルラ環境、定常状態または貪食能、免疫シナプス形成や移行など免疫反応にとって重要な工程で骨髄由来のタンパク質の解析ができました。ここでは、マウス骨髄由来マクロファージと樹状細胞に関心の蛍光タグ付きタンパク質を安定に発現を可能にするプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
標的細胞の興味の蛋白質の表現は、多くの種類の生物学的研究の重要なステップです。分化したマクロファージや樹状細胞が標準のトランスフェクションとレトロ ウイルス伝達技術によって transfect に困難です。これらの異所性 Cdna の発現を許可する重要なステップは、骨髄前駆細胞、分化に続いて彼らは既に目的の構造を運ぶときのレトロ ウイルス伝達のこれらの分化した細胞のトランス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、によってチェコ科学財団 (GACR) (プロジェクト番号 16-07425S)、チャールズ大学グラント機関 (GAUK) (プロジェクト番号 923116) によって、遺伝子、チェコの科学アカデミーの研究所からの資金調達機関でサポートされていた共和国 (RVO 68378050)。
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | For media suplementation |
| KHCO3 | Lachema, Brno, Czech Republic | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, Prague, Czech Republic | N/A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma, Hradec Králové, Czech Republic | N/A | |
| Polyethylenimine, linear, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| PBS | Prepared in-house by media facility of IMG ASCR, Prague, Czech Republic | N/A | |
| APC anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 101212 | flow cytometry analysis |
| PE anti-mouse F4/80 Antibody, clone BM8 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 123110 | flow cytometry analysis |
| APC anti-mouse CD11c Antibody, clone N418 | BioLegend (San Diego, CA, USA) | 117310 | flow cytometry analysis |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | H1398 | flow cytometry analysis use at 1-2 µg/ml |
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