Her beskriver vi en protokoll for biokjemiske karakterisering av gjær RNA-modifisere enzym, Mod5, og diskutere hvordan denne protokollen kan brukes til andre RNA-modifisere enzymer.
N6– isopentenyladenosine RNA modifikasjoner er funksjonelt varierte og høyt konservert blant prokaryoter og eukaryoter. En av de mest høyt konservert N6– isopentenyladenosine modifikasjonene oppstår ved hovedvei A37 plassering i et delsett av tRNAs. Denne endringen forbedrer oversettelse effektivitet og kvalitet ved å øke affinitet av tRNA for ribosomet. Mutasjon av enzymer som er ansvarlig for denne endringen i eukaryoter er forbundet med flere sykdom stater, inkludert mitokondrie dysfunksjon og kreft. Forstå substrat spesifisitet og biokjemiske aktiviteter av disse enzymer er derfor viktig for forståelse av normal og patologisk eukaryote biologi. Et variert utvalg av metoder har vært ansatt som karakteriserer jeg6en modifikasjoner. Her er beskrevet en direkte tilnærming for påvisning av isopentenylation av Mod5. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med en rekombinant isopentenyl transferase, etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse for å oppdage6en modifikasjoner. I tillegg drøftes potensielle tilpasningsevne denne protokollen til å beskrive andre RNA-modifisere enzymer.
Minst 163 distinkte posttranscriptional RNA endringer har blitt identifisert, med disse endringene overdragelse varierte og kontekst-avhengige funksjoner til RNAs direkte påvirke RNA struktur og påvirker interaksjoner av RNA med andre molekyler1,2. Som anerkjennelse for antallet og variasjonen av RNA modifikasjoner øker, er det avgjørende å utvikle analyser som kan pålitelig forhøre både RNA endringene og enzymer som katalysere dem.
En av de første RNA modifikasjonene identifiseres skjer ved base 37 i tRNAs, ved siden av anti-codon på 3 side3,4. En isopentenyl gruppe er overført fra dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) til N6 stillingen adenosin 37 (jeg6hovedvei A37) 3,5 på et delsett av både cytoplasmatiske og mitokondrie tRNAs. Jeg6hovedvei A37 forbedrer oversettelse kvalitet og effektivitet ved å øke den tRNA affinitet for ribosom4,6 og jeg6hovedvei A37 er viktig for stressrespons i bakterier7. Enzymer som utfører denne endringen kalles tRNA isopentenyl transferases og er svært bevart i bakterier8,9, sopp10, ormer11, planter12og høyere eukaryoter13 , inkludert mennesker14.
Mutasjoner i menneskelig tRNA isopentenyl transferase genet, TRIT1, er tilknyttet for menneskelig sykdom. For eksempel er en mutasjon i TRIT1 korrelert med en alvorlig mitokondrie sykdom, trolig forårsaket av en feil i mitokondrie protein syntese15,16. Videre TRIT1 har blitt beskrevet som en tumor suppressor genet17,18 og er involvert i flere typer kreft inkludert melanom19, bryst20, mage21og lunge kreft22 ,23. Til slutt, TRIT1 og Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases er utsatt for aggregering proteiner som danner prion-lignende amyloid fiber24,25,26. Disse observasjonene implisere potensielt tRNA isopentenyl transferases i nevrodegenerative sykdommer, selv om direkte bevis for dette ikke har ennå vist.
Gitt rollen som isopentenyl transferases spiller i oversettelse og sykdom, metoder som direkte måler jeg6en isopentenyl transferase aktivitet er viktig for en mekanistisk forståelse av disse enzymer under normal og sykdomstilstander. Et økende antall metoder er tilgjengelige til å oppdage6A RNA endringer, inkludert i vitro isopentenylation analyser, positiv hybridisering i fravær av jeg6en (PHA6) søk, tynne lag kromatografi (TLC), aminosyre aksept aktivitet analyser og massespektrometri tilnærminger (anmeldt i Ref. 4).
I vitro isopentenylation analysen har blitt beskrevet som benytter 14C-DMAPP og umerkede tRNAs. I denne analysen overføres radioaktivt karbon til RNA fra 14C-DMAPP av isopentenyl-transferase. Denne analysen er svært følsom, er det ofte vanskelig å fastslå den spesifikke resten som er endret9,20,27. PHA6 analyser stole på den store jeg6en endring forstyrrer blanding av en 32P-merket probe spenner endret rester. Slik hybridisering er større i fravær av en jeg6en endring18,28,29. PHA6 analyser er svært følsomme og i stand til å analysere total RNA utvunnet fra mobilnettet lysates. I tillegg gir muligheten til å utforme sonder spesielt for RNA rundt denne metoden betydelig målet fleksibilitet. PHA6 analyser er imidlertid begrenset til karakterisering av endringer som skjer på rester i målrettede området av sonden og er derfor mindre sannsynlig å identifisere romanen endring områder. I tillegg som fravær av binding er et tegn på endring, vil andre endringer eller mutasjoner som påvirker RNA bindende forvirre dataanalyse.
En annen tilnærming kombinerer benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose kromatografi med aminosyre aksept aktivitet som en presentasjon av jeg6en endringer i tRNA30. Denne tilnærmingen direkte søk funksjonen av i6en endring, men det er en indirekte oppdage6en endring og mangler oppløsning å kartlegge endringer i en bestemt rester i RNA. En TLC tilnærming er brukt til å oppdage totalt tRNA jeg6en modifikasjoner. I denne tilnærmingen, internt 32P-merket tRNAs er fordøyd å enkelt nukleotider og todimensjonal TLC analyse brukes til å identifisere isopentenylation. Denne fremgangsmåten er svært følsom oppdage totalt jeg6en i en gitt RNA prøve men på fordøyelsen, alle oppstartsrekkefølgen er tapt; Dermed har etterforskeren ingen måte å bestemme hvilke rester er endret31.
Flere nylig, flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoder har blitt utviklet som kvantitativt sammenligner totalt RNA endringer mellom arter, celletyper og eksperimentelle forhold32,33, 34. En begrensning av denne metoden er at det er mindre i stand til å bestemme identiteten og posisjon i RNA som den endrede nukleosid var avledet34. Videre begrense kompetanse og utstyr som er nødvendig for å utføre disse eksperimentene praktisk bruk av denne tilnærmingen.
I tillegg er flere neste generasjons sekvensering teknologi utviklet for å tilordne RNA endringer transcriptome hele34. Immunoprecipitation av RNAs med antistoffer spesifikke for en bestemt endring (RIP-Seq) aktiverer etterforskeren å identifisere alle sekvenser som inneholder en bestemt endring35,36. I tillegg stole revers transkriptase tilnærminger som Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering på forstyrrelser av omvendt transkripsjon reaksjon på endrede rester37,38,39. Til tross for fordelen av disse teknikkene til å tilordne RNA endringer transcriptome hele, er RIP-seq og Chem-Seq teknologier begrenset av mangel på pålitelige antistoffer eller reaktive kjemikalier tilgjengelig for hver bestemte endringer, henholdsvis34. Videre revers transkriptase enzym kreves for å utføre Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering teknikker kan hindres av stabil RNA. TRNAs svært modifisert og strukturelt stabil natur gjør dem spesielt vanskelig å forhøre disse teknikkene. Hittil har neste generasjons sekvensering-baserte teknologier ikke ennå blitt benyttet til map6en modifikasjoner34.
Her beskriver vi en enkel og direkte tilnærming til å oppdage6en tRNA endringer i vitro. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse til map6en modifikasjoner. Denne tilnærmingen er direkte og krever lite spesialisert kompetanse til å analysere dataene. Videre, denne metoden er tilpasningsdyktig til andre RNA endre enzymer, inkludert enzymer som covalently endrer molekylvekt av RNA eller en RNA mobilitet gjennom en gel.
RNA modifikasjoner fortsette å vises å spille stadig mer viktig og ulike roller i mobilnettet og organismebiologi funksjon. Slik er utvikling av analyser avhøre RNA endre enzymer sentralt for bedre forstå de grunnleggende sidene ved biologi. Denne protokollen beskriver en høy oppløsning i vitro analysen betegner tRNA endring aktiviteten til Mod5.
Denne protokollen har klar fordel av å gi en direkte og enkelt interpretable avlesning av isopentenylation. Protokollen beskrevet gir…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. David Engelke for hans veiledning og nyttige kommentarer på dette manuskriptet. PJS – Ball State University laboratorium oppstart kapital; DAB – gi 1R15AI130950-01.
Reagents | |||
UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
Equipment and Supplies | |||
Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
Plastic wrap | (local grocery store) |