TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil
Summary
Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA değişiklikleri işlevsel olarak farklı ve prokaryot ve ökaryotlar arasında son derece korunmuş. En son derece korunmuş N6– isopentenyladenosine değişiklikler biri A37 konumunu tRNA bir alt oluşur. Bu değişiklik çeviri ve sadakat tRNA benzeşim ribozom artırarak artırır. Mutasyon bu değişiklik ökaryotlarda sorumlu enzim mitokondrial disfonksiyon ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarında ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat özgüllüğü ve biyokimyasal faaliyetleri Bu enzimlerin anlama normal ve patolojik ökaryotik biyoloji anlamak için önemlidir. Yöntemleri çeşitli bir dizi6A değişiklikler ben karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Burada olduğunu isopentenylation Mod5 tarafından algılanması için doğrudan bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem RNA’ların kuluçka ardından RNase T1 sindirim ve ben6A değişiklikleri algılamak için 1 boyutlu jel elektroforez analiz bir rekombinant isopentenyl transferaz ile kullanır. Buna ek olarak, bu protokolün diğer RNA enzimler karakterize etmek için potansiyel uyum ele alınmıştır.
Introduction
En azından 163 ayrı posttranscriptional RNA değişiklikler, farklı ve içerik bağımlı işlevler için RNA’ların veriyor, doğrudan RNA yapısını etkileyen ve diğer RNA’ın etkileşimleri etkileyen bu değişiklikler ile tespit edilmiştir molekülleri1,2. Sayısı ve çeşitliliği RNA değişiklikler için takdir arttıkça, güvenilir bir şekilde RNA Modifikasyon ve onları katalizler enzimler sorguya çekebiliriz deneyleri geliştirmek için önemlidir.
TRNA, bitişik Anti-kodonu 3′ yan3,4temel 37 at tespit edilmesi için ilk RNA değişiklikler oluşur. Bir isopentenyl grubu dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) adenozin 37 N6 konuma aktarılır (ben6A37) bir alt kümesi sitoplazmik ve mitokondrial tRNA 3,5 . Ben6A37 geliştirir çeviri sadakat ve verimliliği artırarak tRNA’ın benzeşme ribozom4,6 ve6A37 stres tepkisi bakteri7için önemli. Bu değişikliği gerçekleştirmek enzim tRNA isopentenyl Transferazlar denir ve bakteri8,9, mantarlar10, solucanlar11, bitkiler12ve daha yüksek Ökaryotlar13 son derece korunmuş , insanlar14dahil olmak üzere.
İnsan tRNA isopentenyl transferaz gen, TRIT1, mutasyonların insan hastalığı ile ilişkilidir. Örneğin, TRIT1 bir mutasyon büyük olasılıkla mitokondrial protein sentez15,16bir kusur nedeniyle şiddetli bir mitokondriyal hastalığı ile ilişkilidir. Ayrıca, TRIT1 bir tümör baskılayıcı gen17,18 açıklanan ve melanom19, meme20, gastrik21ve akciğer kanserleri22 de dahil olmak üzere kanserlerinin bazı türleri karıştığı ,23. Son olarak, TRIT1 ve Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl Transferazlar deli dana gibi amiloid lifleri24,25,26toplama eğilimli proteinleri vardır. Her ne kadar bunun için doğrudan kanıt değil henüz gösterilen bu gözlemler potansiyel tRNA isopentenyl Transferazlar nörodejeneratif hastalıklarda işe bulaştırmak.
İsopentenyl Transferazlar bir isopentenyl transferaz aktivitesini çeviri ve hastalık, doğrudan6ölçmek yöntemleri oynadıkları rolü göz önüne alındığında bu enzimler Normal’in altında ve hastalık durumlarında bir mekanik anlamak için önemlidir. Yöntemleri giderek artan sayıda vitro isopentenylation deneyleri, pozitif hibridizasyon dahil olmak üzere6A RNA değişiklik ben algılamak kullanılabilir ben yokluğunda (PHA6) deneyleri,6ince katman Kromatografi (TLC), amino asit kabul aktivite deneyleri ve kütle spektrometresi yaklaşımlar (Ref. 4yorum).
Bir vitro isopentenylation tahlil 14C-DMAPP ve etiketsiz tRNA kullanır nitelendirdi. Bu tahlil, radyoaktif karbon 14C-DMAPP tarafından isopentenyl transferaz RNA aktarılır. Bu tahlil son derece hassas olmakla birlikte, genellikle bu belirli kalıntı9,20,27değiştiren belirlemek zordur. PHA6 deneyleri itimat hantal üzerinde ben6A değiştirme değiştirilmiş kalıntı kapsayan bir 32P olarak etiketlenmiş sonda hibridizasyon ile müdahale. Bu nedenle, hibridizasyon bir i yokluğunda büyük6bir değişiklik18,28,29. PHA6 deneyleri son derece hassas ve hücresel lysates çıkarılan toplam RNA analiz yeteneğine sahip. Ayrıca, sondalar özel ilgi RNA tasarlamak için bu yöntemi önemli hedef esneklik sağlıyor. Ancak, PHA6 deneyleri artıkları sonda hedeflenen bölge içinde oluşur ve bu nedenle Roman değişiklik siteleri tanımlamak daha az muhtemel değişiklikler karakterizasyonu için sınırlıdır. Buna ek olarak, bağlama yokluğu modifikasyonu göstergesidir gibi diğer değişiklikler veya RNA bağlama etkiler mutasyonlar veri analizi yıkmak da.
Başka bir yaklaşım Benzil DEAE selüloz (BD) selüloz kromatografi tRNA30olarak6A değişiklikleri amino asit kabul aktivite olarak ben, bir okuma ile birleştirir. Bu yaklaşım doğrudan işlev deneyi ‘ nın6A değişiklik, ama ben6A değişiklik algılamak için dolaylı bir yaklaşımdır ve çözünürlük RNA içinde belirli bir kalıntı değişiklikler eşlemek için yoksun. TLC yaklaşım toplam tRNA algılamak için kullanılan ben6A değişiklikler. Bu yaklaşımda, dahili olarak 32tRNA P olarak etiketlenmiş tek nükleotid sindirmek ve iki boyutlu TLC analiz isopentenylation tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım son derece hassas saptamada toplam6A belirli bir RNA örnek ama sindirim tüm sırası bilgi kaybolmadı; Böylece, araştırmacı hiçbir şekilde hangi artıkları değiştirilmiş31olmuştur saptayacak yeterliliğe sahip değildir.
Daha yakın zamanlarda, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemleri kantitatif tür hücre tipleri ve deneysel koşullar32,33arasında toplam RNA Modifikasyon karşılaştıran geliştirilmiştir, 34. Bu metodoloji sınırlamasından kimlik ve hangi değiştirilmiş nükleozit yapıldı RNA içinde pozisyon34türetilmiş belirlemek daha az yetenekli olmasıdır. Ayrıca, uzmanlık ve ekipman bu deneyler yürütmek için gerekli bu yaklaşım pratiklik sınırlayın.
Buna ek olarak, bazı yeni nesil sıralama teknolojileri RNA Modifikasyon transcriptome çapında34eşlemek için geliştirilmiştir. Immunoprecipitation RNA’lar ile antikor belirli bir değişiklik (RIP-Seq) belirli bir belirli değişiklik35,36içeren tüm serileri tanımlamak için Dedektif etkinleştirin. Ayrıca, ters transkriptaz tabanlı yaklaşımlar Kimya-Seq ve rasgele uyuşmazlığı sıralama gibi ters transkripsiyon tepki değiştirilmiş artıkları37,38,39tedirginlikler güveniyor. RNA Modifikasyon transcriptome çapında eşlemek için bu tekniklerin avantaj rağmen RIP-seq ve kimya-Seq teknolojileri güvenilir antikor veya reaktif kimyasallar belirli her değişiklik için sırasıyla34mevcut eksikliği ile sınırlıdır. Ayrıca, ters transkriptaz enzimler Kimya-Seq gerçekleştirmek için gereken ve rasgele uyuşmazlığı sıralama teknikleri istikrarlı RNA yapılar tarafından engellemiştir. TRNA çok değiştirilmiş ve yapısal istikrarlı yapısı onları bu teknikleri kullanarak sorguya çekmek özellikle zor olun. Bugüne kadar yeni nesil teknolojileri dayandırılmış henüz6değişiklikler34ben eşlemek için kullanılmıştır değil.
Burada, ben6A tRNA değişiklikler içinde vitroalgılamak için basit ve doğrudan bir yaklaşım açıklar. Kuluçka RNA’lar ile rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferaz (Mod5), ardından RNase T1 sindirim ve 1 boyutlu jel elektroforez analiz6A değişiklikler ben eşlemek için bu yöntemi kullanır. Bu yaklaşım doğrudan ve verileri çözümlemek için küçük özel uzmanlık gerektirir. Ayrıca, bu yöntem diğer RNA enzimler, kovalent değiştirmek RNA ya da RNA’ın hareketlilik bir jel ile molekül ağırlığı enzimler de dahil olmak üzere değiştirme için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresel ve organizma işlevinde her zamankinden daha fazla önemli ve farklı rolleri oynamak için gösterilecek RNA değişiklikler devam. Bu nedenle, enzimler değiştirme RNA sorgulamaya deneyleri gelişimi biyoloji temel yönlerini daha iyi anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Bu iletişim kuralı Mod5 tRNA değişiklik etkinliği karakterize etmek için yüksek çözünürlüklü vitro tahlil açıklar.
Bu iletişim kuralının isopentenylation bir doğrudan ve kolay y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr David Engelke onun rehberlik ve bu el yazması üzerinde yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. PİJAMA – Ball State University laboratuvar başlangıç fonlar; DAB – 1R15AI130950-01 vermek.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
