Summary

יחידת מידה כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים Kynurenine וחומצה Kynurenic: ביוכימיה הנוגעים קוגניציה ולישון אצל חולדות

Published: August 19, 2018
doi:

Summary

שינויים ב- kynurenine מסלול (KP) neuroactive מטבוליטים הם מעורבים מחלות פסיכיאטריות. חוקרים התוצאה הפונקציונלית של kynurenine שינו מסלול חילוף החומרים של ויוו בחולדות עשוי לעזור להבהיר רומן גישות טיפוליות. בפרוטוקול הנוכחי משלב גישות ביוכימיים והתנהגותיים לחקור את ההשפעה של אתגר kynurenine חריפה אצל חולדות.

Abstract

מסלול kynurenine (KP) של טריפטופן השפלה היה מעורב הפרעות פסיכיאטריות. באופן ספציפי, נגזר אסטרוציט המטבוליט kynurenic חומצה (KYNA), אנטגוניסט-שתי N-מתיל-d-אספרטט (NMDA) ואת רצפטורים אצטילכולין nicotinic (α7nACh) α7, היה מעורב תהליכים קוגניטיביים על בריאות ומחלה. כפי KYNA רמות גבוהות במוחם של חולי סכיזופרניה, תקלה glutamatergic, קולטנים שימוש הוא האמין להיות סיבתי קשורה בתפקוד הקוגניטיבי, תחום הליבה של פסיכופתולוגיה המחלה. KYNA עשוי לשחק תפקיד משמעותי pathophysiologically אנשים עם סכיזופרניה. ניתן להעלות את רמת KYNA אנדוגני במוח מכרסמים על ידי טיפול בבעלי-חיים עם kynurenine bioprecursor ישירה, פרה מחקרים בחולדות הראו כי הגבהים חריפה ב- KYNA עשוי להשפיע את תהליכי הלמידה והזיכרון שלהם. בפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה זו ניסיוני בפירוט, והוא משלב א) ניתוח הביוכימי של רמות kynurenine בדם והמוח היווצרות KYNA (באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים), בדיקת b) התנהגותית כדי לחקור זיכרון הקשרי תלויי-בהיפוקמפוס (פרדיגמה הימנעות פסיבי), ו- c) הערכה על התנהגות שינה [telemetric הקלטות שילוב העוויתיים (EEG) electromyogram (EMG) אותות] אצל חולדות. יחדיו, יחסים בין גבוהות KYNA, שינה, קוגניציה היא למדה, פרוטוקול זה מתאר בפירוט גישה נסיונית להבנת תפקוד תוצאות של העלאת kynurenine ו KYNA היווצרות ויוו בחולדות. התוצאות המתקבלות באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה יהיה לבחון את ההשערה כי KP ואת KYNA לשרת תפקידי מרכזי הכוח ויסות שינה וקוגניציה במצבי בריאות ומחלה.

Introduction

KP אחראי משפילים כמעט 95% של טריפטופן חומצת אמינו חיונית1. במוח של יונקים, kynurenine תוך האסטרוציטים עובר מטבוליזם בתוך המולקולה קטנה neuroactive KYNA בעיקר על ידי האנזים kynurenine aminotransferase (קאט) II2. KYNA פועל כמו אנטגוניסט-קולטני NMDA, α7nACh המוח2,3,4, ואני גם מטרות איתות קולטנים כולל הקולטן פחמימן aryl (אמפר לשעה) ו- G-החלבון בשילוב קולטן 35 (GPR35)5 ,6. בחיות ניסוי, הגבהים במוח KYNA הוכחו לפגום את הביצועים הקוגניטיביים שלהם במערך של מבחני התנהגות2,7,8,9,10 . השערת המתעוררים מרמז על זה KYNA ממלא תפקיד חשוב להתכוונן תפקודים קוגניטיביים על ידי להשפיע על התנהגות שינה11, ובכך תומך עוד יותר את התפקיד של מולקולות נגזר אסטרוציט של להתכוונן לנוירוביולוגיה של שינה, קוגניציה12.

קלינית, הגבהים, KYNA נמצאו השדרתי ורקמות המוח פוסט-מורטם של חולים עם סכיזופרניה13,14,15,16, הפרעה פסיכיאטרית מתישה מאופיין על ידי ליקויים קוגניטיביים. חולי סכיזופרניה מוטרדים גם לעתים קרובות על ידי הפרעות שינה זה עשוי להחריף את המחלה17. להבין את התפקיד של חילוף החומרים KP, KYNA הכוח ויסות גומלין בין שינה, קוגניציה, בעיקר בין למידה וזיכרון, עשויה להוביל לפיתוח טיפולים לטיפול אלה עני תוצאות סכיזופרניה, השני מחלות פסיכיאטריות.

שיטה אמינה ועקבית לשקילת KP מטבוליטים חשוב להבטיח כי המחקר המתעוררים ממוסדות שונים שניתן לשלב את ההבנה המדעית של KP ביולוגיה. כיום, אנו מתארים את המתודולוגיה למדוד kynurenine בפלסמה עכברוש, KYNA במוח חולדה על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). בפרוטוקול הנוכחי, אשר עושה שימוש זיהוי fluorimetric בנוכחות Zn2 +, פותחה לראשונה על ידי Shibata18 ועוד לאחרונה הותאם and אופטימיזציה to derivatize עם 500 מ מ אבץ אצטט כמו טור שלאחר הכימית, המאפשר זיהוי אנדוגני, כמויות nanomolar של KYNA המוח11.

לעורר את הייצור KYNA דה נובו אנדוגני כמפורט בפרוטוקול הנוכחי, kynurenine bioprecursor ישירה מוזרק intraperitoneally (i.p.) בחולדות. בשילוב עם הערכות ביוכימי כדי לקבוע את מידת KYNA ייצור, ההשפעות של kynurenine לקרוא תיגר על הזיכרון תלוי בהיפוקמפוס (הימנעות פסיבי הפרדיגמה) ואת הארכיטקטורה שינה (EEG ו- EMG אותות) הוא גם ובדוקים11. שילוב של שיטות אלה מאפשר חקר ההשפעה הביוכימי ופונקציונליים של יישום kynurenine אתגר ויוו בחולדות.

Protocol

את כל מנגנוני ניסיוני אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מרילנד ועל שימוש הוועדה ועקבתי המדריך מכוני הבריאות הלאומיים של על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. הערה: חולדות Wistar זכר בוגר (250 – 350 גרם) שימשו כל הניסויים. גדודים נפרדים של חיות שימשו עבור ניתוח הביוכימי…

Representative Results

כדי לאמת את השימוש זריקה kynurenine בקרום הבטן כשיטה להעלות את המוח KYNA, בוצע ניתוח HPLC של רקמות. רגיל עקומות (איור 1) נבנו באמצעות התוכנה המשויכים ואת המותר עבור כימות של דגימות רקמה. נציג chromatograms עבור kynurenine ו- KYNA מוצגים באיור2. Kynurenine נצפתה בזמן השמ?…

Discussion

עבור הערכה אמינה של KYNA במוח לאחר המינהל kynurenine היקפיים, חשוב לשלב ולפרש ניסויים הביוכימי ופונקציונליים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר למשתמשים חדשים ליצור שיטות יעילות למדידת פלזמה kynurenine של המוח KYNA של חולדות. המדד של kynurenine ב הפלזמה אישרה הזרקה מדויקת ואת המידה של מטבוליט KYNA מאשרת א?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 NS102209) ותרומה של אמון פורבס קלייר אי.

Materials

Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

References

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia – From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Play Video

Cite This Article
Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

View Video