Cellulær senescens er den vigtigste faktor i udviklingen af kroniske aldersrelaterede patologier. Identifikation af Therapeutics at målrette senescent celler viser løfte om at forlænge sund aldring. Her præsenterer vi en ny analyse til at screene for identifikation af senotherapeutika baseret på måling af senescens associeret β-galactosidase aktivitet i enkeltceller.
Celle senescens er en af kendetegnene ved aldring, der er kendt for at have en negativ indflydelse på en sund levetid. Stoffer i stand til at dræbe senescent celler specifikt i cellekultur, kaldet senolytika, kan reducere den senescent celle byrde in vivo og forlænge healthspan. Flere klasser af senolytika er blevet identificeret til dato, herunder HSP90-hæmmere, BCL-2-familie-hæmmere, piperlongumin, et FOXO4 hæmmende peptid og kombinationen af Dasatinib/quercetin. Påvisning af SA-β-gal ved øget lysosomale pH er en af de bedst karakteriserede markører til påvisning af senescent celler. Levende celle målinger af senescens-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet ved hjælp af det fluorescerende substrat C12FDG i kombination med bestemmelsen af det samlede celle nummer ved hjælp af et DNA-interkalerende Hoechst-farvestof åbner mulighed for at skærm for senotherapeutiske lægemidler, der enten reducerer den samlede SA-β-gal-aktivitet ved at dræbe senescerende celler (senolytika) eller ved at undertrykke SA-β-gal og andre fænotyper af senescent celler (senomorffer). Brug af et højt indhold fluorescerende billede erhvervelse og analyseplatform giver mulighed for en hurtig, høj gennemstrømning screening af narkotika biblioteker for effekter på SA-β-gal, celle morfologi og celle nummer.
Cellulære gulne året blev beskrevet for første gang af Leonard Hayflick og Paul Moorhead, som viste, at normale celler havde en begrænset evne til at formere sig i kultur1. Senescent celler undlader at formere sig på trods af tilstedeværelsen af næringsstoffer, vækstfaktorer og manglende kontakt hæmning, men forbliver metabolisk aktive2. Dette fænomen er kendt som replikerende senescens og blev primært tilskrives telomere, forkortelse, i det mindste i humane celler3. Yderligere undersøgelser har vist, at celler også kan induceres til at gennemgå senescens som reaktion på andre stimuli, såsom onkogen stress (oncogene induceret senescens, OIS), DNA-skade, cytotoksiske lægemidler eller bestråling (stress induceret senescens, SIS)4 , 5 , 6. som reaktion på DNA-skader, herunder telomere, erosion, celler enten senesce, starte ukontrolleret cellevækst, eller gennemgå apoptose, hvis skaden ikke kan repareres. I dette tilfælde, celle senescens synes at være gavnlig, da det virker i en tumor suppressiv måde2. I modsætning hertil øges senescens med aldring på grund af ophobning af cellulære skader, herunder DNA-skader. Da senescent celler kan udskiller cytokiner, metalloproteinaser og vækstfaktorer, betegnet som den senescens-associerede sekretoriske fænotype (SASP), bidrager denne aldersafhængige stigning i cellulær senescens og SASP til nedsat vævs homøostase og efterfølgende ældning. Også denne aldersbetingede stigning i senescens byrden er kendt for at inducere metaboliske sygdomme, stress følsomhed, Progeria syndromer, og forringet helbredelse7,8 og er til dels ansvarlig for de talrige aldersrelaterede sygdomme, såsom åreforkalkning, slidgigt, muskel degeneration, mavesår dannelse, og Alzheimers sygdom9,10,11,12,13. Eliminering af senescent celler kan medvirke til at forebygge eller forsinke vævs dysfunktion og forlænge sociale14. Dette er blevet vist i transgene musemodeller14,15,16 samt ved hjælp af senolytiske lægemidler og narkotika kombinationer, der blev opdaget gennem både Drug screening indsats og bioinformatik analyse af veje induceret specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identificere mere optimale senotherapeutiske lægemidler, i stand til mere effektivt at reducere den senescent celle byrde, er et vigtigt næste skridt i udviklingen af terapeutiske tilgange til sund aldring.
Senescent celler viser karakteristiske fænotypiske og molekylære egenskaber, både i kultur og in vivo. Disse senescens markører kan være enten årsag eller resultat af senescens induktion eller et biprodukt af molekylære ændringer i disse celler. Men, ingen enkelt markør er fundet specifikt i senescent celler. I øjeblikket er gulne året-associeret β-galactosidase (SA-β-gal) detektion en af de bedst karakteriserede og etablerede enkelt cellebaserede metoder til måling af senescens in vitro og in vivo. SA-β-gal er en lysosomale hydrolase med en optimal enzymatisk aktivitet ved pH 4. Måling af dets aktivitet ved pH 6 er muligt, fordi senescent celler viser øget lysosomale aktivitet23,24. For levende celler opnås øget lysosomale pH ved lysosomale alkalinisering med vakuolær H+-ATPase-hæmmeren bafilomycin a1 eller den endosomale forsurings hæmmer chloroquin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) anvendes som substrat i levende celler, da det bevarer det spaltet produkt i cellerne på grund af dets 12 Carbon lipofile-delen25. Vigtigere er det, at SA-β-gal-aktiviteten ikke er direkte forbundet med nogen vej, der er identificeret i senescent celler, og at den ikke er nødvendig for at fremkalde en Med denne analyse kan senescent celler identificeres selv i de heterogene cellepopulationer og aldrende væv, såsom hudbiopsier fra ældre individer. Det er også blevet brugt til at vise en sammenhæng mellem celle senescens og aldring23 , da det er en pålidelig markør for senescent celle detektion i flere organismer og betingelser27,28,29, 30. Her beskrives en høj gennemløbs-SA-β-gal-Screenings analyse baseret på det fluorescerende substrat C12FDG ved hjælp af primære mus embryonale fibroblaster (mefs) med robust oxidativ stress induceret celle stabilitet og dens fordele og ulemper drøftes. Selv om denne analyse kan udføres med forskellige celletyper, brugen af Ercc1-mangelfuld, DNA reparation svækket mefs giver mulighed for hurtigere induktion af senescens under forhold af oxidativ stress. I mus medfører reduceret ekspression af DNA-reparationen endonuklease ERCC1-XPF nedsat DNA-reparation, accelereret akkumulering af endogene DNA-skader, forhøjede ROS, mitokondriel dysfunktion, øget senescent celle byrde, tab af stamcelle funktion og for tidlig aldring, svarende til naturlig aldring31,32. På samme måde undergår Ercc1-mangelfulde mef’er en hurtigere senescens i kultur17. Et vigtigt element i den senescent MEF assay er, at hver brønd har en blanding af senescent og ikke-senescent celler, giver mulighed for en klar demonstration af senescent celle-specifikke effekter. Men selv om vi mener, at brugen af oxidativt stress i primære celler til at fremkalde senescens er mere fysiologisk, kan denne analyse også bruges med cellelinjer, hvor senescens induceres med DNA-skadelige stoffer som etoposid eller bestråling.
SA-β-gal er en veldefineret biomarkør for cellulær senescens, som oprindeligt blev opdaget af Dimri et al. (1995) viser, at senescent humane fibroblaster har øget aktivitet af SA-β-gal, når de er analyseret ved pH 623 sammenlignet med prolifererende celler. I mellemtiden er der foretaget in vitro-og in vivo-assay for SA-β-gal for forskellige celletyper og væv25,39,40. Den fluorescens base…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH Grants AG043376 (projekt 2 og Core A, PDR; Projekt 1 og Core B, LJN) og AG056278 (projekt 3 og Core A, PDR; og projekt 2, LJN) og et tilskud fra Glenn Foundation (LJN).
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |