एक correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) विधि पहले प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) द्वारा चयनित कर रहे हैं कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के माध्यम से छवि वायरस प्रेरित intracellular संरचनाओं के लिए लागू किया जाता है. एल एम और EM एक संकर इमेजिंग दृष्टिकोण के रूप में संयुक्त करने के लिए वायरस की एक एकीकृत दृश्य-मेजबान बातचीत को प्राप्त कर रहे हैं ।
अपने उच्च संकल्प के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) virologists के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है । हालांकि, मुख्य कठिनाइयों का विश्लेषण जब उंहें वायरस संक्रमित या transfected कोशिकाओं के माध्यम से उंहें संक्रमण या अभिकर्मक की कम क्षमता है, इन कोशिकाओं की परीक्षा में बाधा । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) पहले संक्रमित या transfected कोशिकाओं के उपजनसंख्या आवंटित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग का लाभ लेने (एफपीएस) वायरल प्रोटीन से जुड़े, LM यहां प्रयोग किया जाता है “सकारात्मक-transfected” कोशिकाओं की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए, एक FP व्यक्त और एक अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के साथ एक समर्थन पर बढ़ रही है । बाद में, कोशिकाओं को आगे उच्च दबाव ठंड (HPF), फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस) और राल embedding के माध्यम से उंहें के लिए संसाधित कर रहे हैं । अल्ट्रा तेजी से ठंड कदम चयनित कोशिकाओं है कि तब संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा ultrastructural स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है की उत्कृष्ट झिल्ली संरक्षण सुनिश्चित करता है । यहाँ, एक कदम दर कदम correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) कार्यप्रवाह प्रदान की जाती है, विस्तार में नमूना तैयारी, इमेजिंग और सहसंबंध का वर्णन. प्रायोगिक डिजाइन भी कई सेल जीव विज्ञान के सवालों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है ।
एक विशिष्ट जैविक प्रक्रिया की एक बेहतर तस्वीर प्राप्त करने के लिए दो माइक्रोस्कोपी मोडलों के संयोजन के विचार के बजाय पुराना है । इस प्रकार, “correlative माइक्रोस्कोपी” का उपयोग कर वायरस के बारे में बहुत पहले अध्ययन १९६० में दो अलग प्रकाशनों1,2के रूप में प्रकाशित किया गया था । उस अध्ययन में, लेखकों दो माइक्रोस्कोपी तकनीक के माध्यम से एडिनोवायरस द्वारा प्रेरित नाभिक की आकृति विज्ञान में परिवर्तन का विश्लेषण किया. प्रथम प्रकाशन में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) प्रेक्षणों को एडीनोवायरस संक्रमण से जुड़े रूपात्मक विवरण का वर्णन करते हुए1बताया गया. एक दूसरे प्रकाशन में, विभिंन संरचनाओं द्वारा मनाया उंहें प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) histochemical धुंधला पैटर्न के छवियों के साथ संबंधित थे, संरचनाओं की प्रकृति को परिभाषित करने के लिए पहले उंहें2द्वारा मनाया ।
इन प्रारंभिक अध्ययनों में, तथापि, स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में तैयार विभिन्न संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए उनकी टिप्पणियों का प्रदर्शन किया गया. “सहसंबंध” था, वास्तव में, दो इमेजिंग विधियों से आ रही जानकारी के संयोजन के रूप में एक निश्चित घटना को समझने के लिए, सभी निष्कर्षों है कि विभिंन परख के साथ प्राप्त किया गया है क्रम में समझने के लिए एक जैविक दिया तुलना प्रक्रिया.
आजकल, शब्द correlative माइक्रोस्कोपी, भी correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) के रूप में जाना जाता है, विधियों की एक बढ़ती हुई संख्या के लिए लागू किया जाता है (संदर्भ में समीक्षित3,4,5), समानता के साथ कि दोनों इमेजिंग तकनीक (LM और उंहें) बाहर बहुत ही नमूना पर किए जाते हैं । दोनों तरीकों के परिणाम के संयोजन, इस प्रकार, एक बहु में, मॉडल, बहु पैमाने पर और उस नमूने3के बहु आयामी विश्लेषण । लाभ कर रहे है कि एल एम कई विभिंन कोशिकाओं का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान कर सकते हैं, कोशिका उपजनसंख्या एक विषम कोशिका जनसंख्या के भीतर एक प्रोटीन या ब्याज की प्रोटीन व्यक्त की पहचान को सक्षम करने से । EM LM के संकल्प सीमा पर काबू पाता है, एक विशेष intracellular घटना की एक उच्च संकल्प छवि प्रदान करते हैं । इसके अलावा, EM गैर के दृश्य सक्षम बनाता है-फ्लोरोसेंट उपसेलुलर संदर्भ, सभी झिल्ली organelles बाध्य सहित, बड़े macromolecular परिसरों (जैसे, ribosomes, centrioles, आदि) और cytoskeletal तत्वों, जिससे अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान करना, तथाकथित “संदर्भ अंतरिक्ष”6, और फ्लोरोसेंट जगह LM द्वारा पता चला संदर्भ दे रही है ।
पिछले कुछ वर्षों के दौरान, भूखों न केवल सेल जीव5के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, लेकिन यह भी virologists के लिए (संदर्भ7में समीक्षा की) जटिल वायरस सेल बातचीत है कि एक सफल वायरस के प्रसार के लिए नेतृत्व को समझने के लिए तैयार । इस प्रकार, समझ कैसे वायरस कोशिका झिल्ली को संशोधित करने और अपने स्वयं के लाभ के लिए organelles एंटीवायरल दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है रोगजनक वायरस के उंमूलन ।
यहां, एक भूखों विधि वर्णित है कि वायरल प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफ पी) से जुड़े व्यक्त कोशिकाओं के एल एम द्वारा पता लगाने की अनुमति देता है । इन कोशिकाओं को बाद में क्रायो-मैटीरियल और आगे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के माध्यम से ultrastructural विश्लेषण के लिए तैयार है कि कैसे इन प्रोटीन की अभिव्यक्ति intracellular झिल्ली (चित्रा 1) को पुनर्व्यवस्थित में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए । भूखों को दिनांक8,9,10,11,12,13,14 को प्रकाशित वायरोलॉजी अध्ययन के अधिकांश में रासायनिक निर्धारित कक्षों के साथ प्रदर्शन किया गया है ,15,16,17,18,19। यह मुख्य रूप से, क्रायो-2 और-3 (बीएसएल-2 और बीएसएल-3) प्रयोगशालाओं, जहां कोशिकाओं के स्थिरीकरण संभव नहीं है आमतौर पर के लिए सुरक्षा कारणों के लिए संक्रामक सामग्री को निष्क्रिय करने की जरूरत के कारण है । उन सवालों के लिए सेल झिल्ली के एक इष्टतम संरक्षण की आवश्यकता होती है, उच्च दबाव ठंड (HPF) के माध्यम से vitrification है, तथापि, उच्च20की सिफारिश की । इन मामलों में यहां बताए गए भूखों को प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है । दिलचस्प है, खासकर जब संक्रामक नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, HPF नमूनों कि पहले रासायनिक निष्क्रिय किया गया है पर किया जा सकता है, उदाहरण के लिए बीएसएल में-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं । HPF के बाद रासायनिक निर्धारण के संयोजन से कम से आंशिक रूप से लाभ क्रायो के लाभ के लिए संभावना है-संरक्षण विधियों21,22.
चित्रा 1 : कार्यप्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भूखों । पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं को पहले एल एम द्वारा विश्लेषण कर रहे है उंहें EM के लिए अपने प्रसंस्करण से पहले एफपीएस व्यक्त कोशिकाओं स्थानीयकृत । एक बार स्थित है, कोशिकाओं को तुरंत HPF और एफएस द्वारा तय कर रहे है बाद में राल में एंबेडेड हो । राल के बहुलकीकरण पर, समर्थन जहां कोशिकाओं (= नीलमणि डिस्क) बढ़ रहे थे राल ब्लॉक से हटा दिया जाना चाहिए । ब्लॉक एंबेडेड कोशिकाओं से युक्त एक छोटे trapezium जिसमें से शेष कोशिकाओं, एफपीएस व्यक्त करने के लिए छंटनी की है, एक हीरे चाकू के साथ खोदी हैं । Ultrathin वर्गों स्लॉट ग्रिड पर एकत्र कर रहे है और आगे उनि द्वारा जांच के लिए इन कोशिकाओं के ultrastructural जानकारी प्राप्त करते हैं । यह आंकड़ा अनुकूलित और29संदर्भ से अनुमति के साथ संशोधित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
यहां प्रस्तुत भूखों की कार्यप्रणाली के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक वायरल प्रोटीन अभिव्यक्ति कोशिका झिल्ली पर सफलतापूर्वक किया गया है स्पष्ट करने से पहले HCV प्रतिकृति-संबद्ध संरचनाओं, मुख्य रूप से डबल झिल्ली बुलबुले (DMVs)21, के रूप में अच्छी तरह के रूप में करने के लिए इन HCV-प्रेरित संरचनाओं को बनाने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण बिल्डिंग ब्लॉकों का निर्धारण23. ध्यान दें कि हमारी पहली काम में भूखों का उपयोग करने के लिए HCV प्रतिकृति21अध्ययन, प्रोटोकॉल का एक थोड़ा संशोधित संस्करण यहां लागू किया गया था । उस अध्ययन में, पारंपरिक ०.०५ mm मोटी नीलमणि डिस्क, अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के बिना, उपयोग किया गया जिसमें एक संदर्भ पैटर्न कार्बन कोटिंग के द्वारा उंहें शीर्ष पर एक खोजक ग्रिड के साथ बनाया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) । वर्तमान प्रोटोकॉल के इस संस्करण को अंततः लागू किया जा सकता है, लाभ के साथ कि “HPF के लिए एक वाहक” सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, इसे काटने के नीचे की जरूरत के रूप में चित्रा 3एके बिना । वैकल्पिक रूप से, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, एक मोटा “एक वाहक” का उपयोग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) नमूनों नीलमणि डिस्क के साथ, एक “बी” वाहक की आवश्यकता के बिना ।
दिलचस्प है, इस प्रोटोकॉल को न केवल बीएसएल-1 नमूनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे वायरल प्रोटीन के साथ transfected कोशिकाओं के रूप में यहां और कहीं और19,23, लेकिन यह भी वायरस संक्रमित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए । हालांकि मानव रोगजनकों के साथ काम करना आमतौर पर बीएसएल-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं के लिए प्रतिबंधित है, कुछ देशों में यह अभी भी इन सुरक्षा शर्तों के तहत क्रायो-स्थिरीकरण करने के लिए संभव है । उन बीएसएल-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं में जहां vitrification संभव नहीं है, स्थानीय विनियमों या एक HPF मशीन के अभाव के कारण, वायरस संक्रमित कोशिकाओं को अभी भी इस पद्धति का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है यदि aldehydes के साथ रासायनिक निर्धारण अग्रिम रूप से किया जाता है, अर्थात् बीएसएल-2 या बीएसएल-3 सुविधाओं को छोड़ने से पहले । इसके अलावा, aldehydes को प्रतिदीप्ति रखने के लिए निर्धारण के तुरंत बाद बुझती है, जबकि प्रोटोकॉल के बाकी एक यहां वर्णित के समान है की जरूरत है । इस तकनीक को निरर्थक माना जा सकता है क्योंकि कोशिकाएँ दो बार, रासायनिक रूप से और vitrification के जरिए तय होती हैं. हालांकि, इस दोहरे निर्धारण प्रोटोकॉल वास्तव में21HCV रासायनिक निर्धारण के अधीन कोशिकाओं में पाया DMVs की तुलना में प्रेरित DMVs के एक बहुत बेहतर संरक्षण करने के लिए सुराग ।
आगे संशोधनों के लिए और समस्या निवारण पाठक इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल हिस्सा भर में नोटों को भेजा जाता है । इन नोटों नुकसान का वर्णन से बचने के लिए, साथ ही साथ विकल्प ख्यात कठिनाइयों है कि पैदा हो सकता है जब इस विधि प्रदर्शन पर काबू पाने के लिए ।
इस तकनीक को लागू करने के लिए मुख्य अपेक्षित एक HPF मशीन है । जब क्रायो-HPF के माध्यम से कोशिकाओं को स्थिर (एक HPF मशीन के अभाव के कारण) संभव नहीं है या आवश्यक नहीं है (जब झिल्ली संरक्षण इष्टतम होने की जरूरत नहीं है), कोशिकाओं को रासायनिक तय किया जा सकता है और बाद में तैयार और उंहें8द्वारा विश्लेषण, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. यह विकल्प नीलमणि डिस्क के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, लेकिन कक्ष या सेल समूहों को स्थानांतरित करने के लिए gridded पैटर्न के साथ सेल संस्कृति व्यंजन । इन व्यंजनों के उपयोग का मुख्य लाभ नीलमणि डिस्क की तुलना में उनके बड़े व्यास है, बड़े सतह क्षेत्रों की स्क्रीनिंग की अनुमति । इस प्रकार, इस भूखों प्रोटोकॉल के आवेदन सफलतापूर्वक HCV15 के खिलाफ एक एंटीवायरल यौगिक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या noroviruses19के संरचनात्मक प्रोटीन द्वारा प्रेरित झिल्ली पुनर्व्यवस्थाओं कल्पना करने के लिए लागू किया गया है । एक वाणिज्यिक FS डिवाइस की अनुपस्थिति इस विधि के प्रदर्शन को सीमित कर सकते है जो किसी अंय समस्या है । इस मामले में, बुनियादी घर का बना एफएस प्रणालियों के बजाय उपयोग किया जा सकता है । हालांकि स्वत: FS उपकरणों से निपटने की दुर्घटनाओं को कम कर सकते हैं, घर का बना उपकरणों सफलतापूर्वक उदाहरण के लिए केंट मैकडॉनल्ड्स30 और पॉल वाल्थर लैब्स में इस्तेमाल कर रहे हैं ।
रासायनिक निर्धारण के संबंध में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल intracellular संरचनाओं20के एक इष्टतम संरक्षण सुनिश्चित करता है । इसलिए, मामले में उपर्युक्त HPF और FS उपकरणों उपलब्ध हैं, vitrifying ब्याज की कोशिकाओं को पसंद किया जाएगा ।
इस भूखों दृष्टिकोण के लिए भविष्य के विकल्प न केवल ultrastructural स्तर पर 2d जानकारी प्राप्त करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की संभावना शामिल हैं, लेकिन यह भी झिल्ली और organelle परिवर्तन वायरस की वजह से वास्तुकला के बारे में 3 डी जानकारी हासिल करने के लिए । 3 डी EM तरीके, इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (एट) और केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मिथ्या-SEM) (बड़े पैमाने पर29में वर्णित), भी कोशिकाओं है कि इस मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद तैयार किया गया है पर लागू किया जा सकता है21, 31. इसके अलावा, 3 डी जानकारी भी LM स्तर पर प्राप्त किया जा सकता है, जब एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, जो जेड के अधिग्रहण के ढेर की अनुमति देता है । वास्तव में, यह विकल्प अत्यधिक अनुशंसित है जब LM और EM डेटासेट के बीच एक सटीक सहसंबंध वांछित है (उदाहरण के लिए17देखें) । जानकारी 3 डी में शामिल z-पोट एड्स 2d उनि छवियों के साथ संबंध में सुधार होगा । इस प्रकार, इस तरह के एक परिदृश्य में, सबसे अच्छा फिटिंग LM और EM छवियों का चयन किया जा सकता है और फिर इस तरह के चुनाव आयोग के रूप में उपलब्ध सहसंबंध सॉफ्टवेयर में से एक के अधीन, बर्फीले के भूखों प्लगइन (http://icy.bioimageanalysis.org/)३२ या मील का पत्थर पत्राचार प्लगइन छवि जंमू (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), अतिव्यापी LM-EM छवियों की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप ।
जब लौकिक जानकारी के लिए एक निश्चित घटना के कैनेटीक्स समझने की जरूरत है, समय चूक इमेजिंग के संयोजन में उंहें जीवित कोशिकाओं की गतिशीलता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ब्याज की घटना के दौरान, कोशिकाओं को तुरंत तय कर रहे हैं, एक “जमे हुए स्नैपशॉट” है कि बाद में उंहें के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है सृजन, स्थिरीकरण के समय उस विशेष क्षण के बारे में विस्तृत ultrastructural जानकारी प्रदान । “जमे हुए स्नैपशॉट” प्राप्त करने के लिए, वास्तविक समय में अवलोकन के बाद, कोशिकाओं को या तो रासायनिक३३ या क्रायो-मैटीरियल6तय किया जा सकता है । चूंकि कई सेलुलर प्रक्रियाओं रासायनिक निर्धारण की प्रसार प्रक्रियाओं की तुलना में तेजी से होते हैं, यदि संभव हो तो, अल्ट्रा तेजी से ठंड प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, यह HPF मशीनों उनके प्रभावी समय समाधान३४में अलग खाते में लेने के लिए महत्वपूर्ण है ।
इसके अलावा, हालांकि इस प्रोटोकॉल एक epoxy राल में कोशिकाओं की embedding के लिए डिजाइन किया गया है, कोशिकाओं को भी कम चिपचिपापन रेजिन में एंबेडेड किया जा सकता है, ऐसे Lowicryls, lr सफेद या lr सोने के रूप में । इन एंबेडिंग मीडिया के उपयोग के लिए antigenicity३५,३६, साथ ही साथ प्रतिदीप्ति३७,३८ और, इसलिए, ज्यादातर पद के लिए इस्तेमाल किया जाता है-embedding पर धारा immunolabeling३९ के संरक्षण के लिए सक्षम बनाता है , ४० और पर धारा भूखों४१,४२,४३,४४, जहां एल एम एंबेडिंग के बाद किया जाता है । दोनों दृष्टिकोण (इंयूनो और पर धारा भूखों) उन प्रयोगों जिसमें गैर विशेषता संरचनाओं के माध्यम से आसानी से पाया जा सकता है और/या LM और EM संकेतों के बीच संबंध के खिलाफ एक नियंत्रण के रूप में के लिए महत्वपूर्ण होना चाहिए । इसी तरह, एंटीबॉडी के साथ लेबल है कि दोनों इमेजिंग तरीके से visualized किया जा सकता है (lm और उंहें)४५ बाहर किया जा सकता है क्रम में करने के लिए, उदाहरण के लिए, LM में transfected कोशिकाओं की पहचान (पूर्व embedding चरण) और एक बहुत अधिक सटीक स्थानीयकरण प्राप्त इंयूनो द्वारा अपनी विशिष्ट लेबलिंग के द्वारा GFP संकेत-EM (पोस्ट embedding चरण) । यह ध्यान में रखा जाना चाहिए, तथापि, कि permeabilization एल एम से पहले आयोजित किया जाता है intracellular अंतरिक्ष के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति है, जो एक उप में परिणाम हो सकता है, EM स्तर पर सेल वास्तुकला के इष्टतम संरक्षण । दिलचस्प है, इस प्रोटोकॉल भी अच्छी तरह से बहु के लिए अनुकूल रंग प्रयोगों कि अंय फ्लोरोसेंट टैग के उपयोग के साथ प्राप्त किया जा सकता है, GFP के अलावा अंय (के रूप में यहां दिखाया गया है) । अंत में, वहां इस प्रोटोकॉल, दोनों LM पर और/या EM पक्षों पर, कि सवालों को संबोधित किया जा रहा है पर निर्भर करता है अनुकूलन के कई ख्यात संभावनाएं हैं । अंय वैकल्पिक प्रोटोकॉल के एक व्यापक विवरण के लिए पाठक5,४६को संदर्भित किया जाता है । कैसे माइक्रोस्कोप मोडलों संयुक्त कर रहे हैं की परवाह किए बिना, एक साथ परिणाम जानकारी का एक लाभ है, हमें बेहतर कैसे वायरस और उनके प्रोटीन वास्तविक जीवन में उनके मेजबान के साथ बातचीत को समझने के लिए अनुमति देता है ।
इस विधि के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम ब्याज की कोशिकाओं से धारावाहिक वर्गों का संग्रह है । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रकाश डाला, यह विशेषज्ञ कर्मचारियों की आवश्यकता है, साथ ही धैर्य का एक बहुत । महत्वपूर्ण बात, इस कदम को दो कारणों के लिए EM स्तर पर वापस कोशिकाओं को खोजने के लिए आवश्यक है । पहले, भूखों प्रोटोकॉल के इस प्रकार में पूर्व-embedding lm का उपयोग कर, निर्देशांक केवल lm स्तर पर दिखाई देते हैं और embedding के बाद राल ब्लॉक चेहरे पर. हालांकि, वे उनि द्वारा वर्गों पर दिखाई नहीं होगा । इसलिए, ब्लॉक ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों के लिए नीचे चेहरे पर छंटनी लक्षित एक उस्तरा ब्लेड के साथ ध्यान से पूरा किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि वर्गों है कि बाद में प्राप्त कर रहे है एक दी FP व्यक्त कोशिकाओं होते हैं । दूसरा, “स्कैनिंग” कई वर्गों के लिए LM और EM अधिग्रहण के बीच सबसे अच्छा ओवरले खोजने के लिए आवश्यक है । तरीके जहां एल एम के बाद में किया जाता है इसके विपरीत-embedding चरण, इस मामले में lm-EM ओवरले इतना सटीक नहीं है । कम ओवरले सटीकता एल एम और em के बीच अक्षीय संकल्प में मतभेदों के कारण है, उंहें के नमूना प्रसंस्करण के दौरान संकोचन, और संपीड़न४२के दौरान । फिर भी, इस तरह के स्थलों के उपयोग के रूप में कुशल ट्रैकिंग तरीकों, कोशिकाओं को वापस खोजने में मदद । यह एक कोशिका की स्थिति को दूसरे में शामिल है, साथ ही साथ कोशिकाओं और उनके नाभिक के आकार । इस संबंध में, के रूप में प्रोटोकॉल में बताया, उद्योग के चित्र “शारीरिक” कोशिकाओं है कि सहसंबंध में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है की जानकारी प्रदान करते हैं । वैकल्पिक रूप से, नाभिक या अंय अच्छी तरह से पहचानने वाले सेल organelles (जैसे mitochondria या लिपिड बूंदों) LM से पहले दाग और स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अंत में, यह उल्लेख करने के लिए उल्लेखनीय है कि यद्यपि इस पांडुलिपि वायरोलॉजी अध्ययन के लिए इस तकनीक के उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया है, इस प्रायोगिक डिजाइन की गुंजाइश को और अधिक सामांय जैविक प्रश्नों के पते को विस्तार दिया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम EMBL (हीडलबर्ग) में और हीडलबर्ग विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर सुविधाओं (EMCF) के स्टाफ के सदस्यों के लिए बहुत आभारी हैं । हम भी Ulrike Herian, स्टेफ़नी कैलिस और Andrea Hellwig (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय), के रूप में अच्छी तरह के रूप में Eberhardt श्मिट और renate Kunz विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए (उल्म विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । R.B. और उनकी टीम (U.H. और I.R.-बी.) द्वारा काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 और TRR83, TP13 द्वारा समर्थित किया गया था ।
UV Crosslinker | Stratagene | 400072 | Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each. |
Patterned sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 627 | They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
Slim and long tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72919-SS | "Style SS", for handling sapphire discs. |
Cell culture medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 41965-062 | Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each. |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25030-123 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Nonessential amino acids | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11140-068 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-163 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Fetal calf serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA | F7524 | Bottle of 50 ml. |
Inverted microscope | Olympus Deutschland, Hamburg, Germany | CKX41 | It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability. |
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase | Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory | Not available | Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de. |
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus Bio LLC, Madison, USA | MIR 2304 | Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml. |
Inverted widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany | Zeiss Observer.Z1 | Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures. |
1-hexadecene | Merck, Darmstadt, Germany | 8220640100 | Bottle of 100 ml. |
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 241 | This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
"B" aluminium holders for HPF | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 242 | This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 737 | This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
Sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 405 | These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs. |
Finder grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA | LF135-Cu | These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial. |
HPF machine | ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland | HPM 01 | This HPF machine has been used for this protocol. |
HPF machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EMPACT 2 | "EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above). |
Cryo-tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Z763667-500EA | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials. |
Liquid nitrogen dewar | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | GZ-05094-60 | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes. |
Automatic freeze substitution (AFS) machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EM AFS2 | This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins. |
Osmium tetroxide (OsO4) | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 19150 | 4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules. |
Uranyl-Acetate (UA) | Serva, Heidelberg, Germany | 77879.01 | Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O. |
Sonicator | Bandelin Electronic, Berlin, Germany | 329 | "Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium. |
Glass-distilled acetone | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 10015 | Bottle of 100 ml. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica M80 | Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images. |
Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 14120 | Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers. |
Flow through rings | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707157 | Package containing 100 pieces. |
Reagent baths | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707154 | Package containing 100 pieces. |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica EM UC7 | Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature. |
Ultra 35° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau Switzerland |
AGG339-735 | This knife have an edge length of 3 mm. |
Ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | E78318 | "Style 3X", for handling EM grids. |
EM slot grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | G2010-Cu | 100 grids/vial. |
EM grid storage box | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 71155 | It has capacity for 100 grids. |