Hovedfokuset for denne protokollen er effektivt isolere levedyktig primære glomeruli kulturer med minimal forurensninger for bruk i en rekke nedstrøms programmer. De isolerte glomeruli kan beholde strukturelle relasjoner mellom komponent celletyper og kultivert ex vivo for en kort tid.
Bevaring av glomerular struktur og funksjon er sentral i forebygging av glomerulonefritt, en kategori preget av proteinuria som kan føre til kronisk nyresykdom og end-stegs nyre sykdom. Glomerulus er en kompleks apparater ansvarlig for filtrering av plasma fra kroppen. I sykdom, strukturell integritet går tapt og tillater unormal lekkasje av plasma innholdet i urinen. En metode for å isolere og undersøke glomeruli i kultur er avgjørende for studiet av disse sykdommene. Effektiv metode for å hente intakt glomeruli fra voksen rotte nyrer mens bevaring strukturelle og morfologiske kjennetegn er beskrevet i denne protokollen. Denne prosessen er i stand til å generere høy avkastning av glomeruli per nyre med minimal forurensning fra andre nyre segmenter. Med disse glomeruli, kan skade forhold bli etterlignet av rugende dem med en rekke kjemiske giftstoffer, inkludert protamine sulfate, som forårsaker fot prosessen effacement og proteinuria i dyremodeller. Skadegrad kan vurderes overføring elektronmikroskop, immunofluorescence flekker og vestlige blotting. Nephrin og Wilms Tumor 1 (WT1) nivåer kan også vurderes fra disse kulturene. Letthet og fleksibilitet i denne protokollen, kan de isolerte glomeruli benyttes som beskrevet eller på en måte som best passer behovene til forskeren til å bedre studie glomerular helse og struktur i syke stater.
Glomerulus er en høyt spesialisert dusk av kapillærene ansvarlig for filtrering av sirkulerende plasma. Den danner begynnelsen av nyre, som er grunnleggende funksjonell enhet av nyrene. Glomerular-funksjonen er definert av et unikt fenestrated kapillær endotelet, slit membranen av podocytes og en mellomliggende kjelleren membran. Disse lagene danner en semipermeable barriere å tillate selektiv utskillelse av stoffer i filtratet. Vann, ioner og andre små molekyler generelt passere gjennom, mens større molekyler beholdes i plasma. Podocytes er spesialisert epitelceller som spredt over kjelleren membranen, rundt kapillærene med cytoplasmatiske anslag kjent som foten prosesser. Foten prosesser av tilstøtende podocytes interdigitate og er krysset av slit membraner består av proteiner som nephrin, podocin, P-cadherin og ZO-1-1. I tverrsnitt, disse foten prosesser er jevnt arrangert over kjelleren membranen. I syke glomeruli blir foten prosessene grovt unormal eller “visket ut,” fører til unormal lekkasje av plasma innholdet i filtratet. Slik er glomerular skader vanligvis preget av tilstedeværelsen av unormalt store mengder protein (f.eks proteinuria) og/eller røde blodlegemer (f.eks hematuria) i urinen. I tillegg mister skadet podocytes uttrykk for nephrin så vel som dens regulator Wilms Tumor 1 (WT1), en nøkkel protein ansvarlig for vedlikehold av differensiering2,3. Glomeruli er en primær målet for skade i diabetiker nephropathy og andre glomerulonephritides som minimal endre sykdom og membranous nephropathy fokal Segmentinformasjon glomerulosclerosis. Disse sykdommene er viktige årsaker til progressiv nyresvikt og utviklingen av end-stegs nyre sykdom, en tilstand der overlevelse avhenger på dialyse eller nyre transplantasjon. Derfor er det viktig å studere glomeruli for bedre å forstå kroniske nyre sykdom (Parallelt) patologi.
En celle kultur-systemet er kritisk til å studere glomerular biologi. På grunn av sin sentrale rolle generere slit mellomgulvet, samt eksistensen av spesifikke proteinuric sykdommer på grunn av slit membran protein mutasjoner, har mye forskning forståelig nok utnyttet podocyte isolert. Dette har ført til generasjon av primære podocyte linjer å utnytte i vitro. Disse cellene kan kultivert under en rekke forhold og kan selv dyrkes på permeable støtter å vurdere permeabilitet4. Imidlertid velger isolering av voksende celler ofte dedifferentiated celler som har mistet noen av sine podocyte markører. Dette har ført til generasjon av betinget udødelighet podocytes avledet fra en transgene musen belastning bærer en temperatur-sensitive mutant av SV40 store T genet (f.eks immortomouse), som kan dyrkes i kultur, men også være differensiert for å uttrykke full rekke podocyte indikatorer5. Disse metodene primære kultur har vært sentral i forståelse podocyte biologi4,6,7.
Likevel, kulturer som inneholder enkelt celletyper mangler intercellulære relasjonene som oppstår i vivo samt støttestruktur og matriser, og monolayers av disse cellene nødvendigvis er recapitulate ikke den tredimensjonale arkitektur for glomeruli. Den udødeliggjort podocytes kan også være tungvint og utfordrende å kultur8, og krever besittelse av enten på immortomouse eller en start aliquot av celler fra etablerte etterforskerne å komme i gang. Videre, glomerulus består av ikke bare podocytes, men også kapillær endotelceller i kjelleren membran, samt mesangial celler som gir støtte for strukturen. Derfor er det nyttig å utvikle en ex vivo tilnærming tilgjengelig til alle etterforskere for studier av intakt glomeruli som beholder sin opprinnelige arkitektur samt alle cellene utgjør den normale glomerulus.
I 1958 beskrevet kokk og Pickering første isolering av glomeruli fra kanin nyrene. Etter observasjoner at fett emboli ble fremlagt i glomeruli, postulerte de at partikler av samme størrelse kan brukes spesielt isolere disse strukturene. Faktisk tilførsel av jernoksid partikler i nyret førte til fangst av disse partiklene i glomeruli. Etter mekanisk dissosiasjon og sikting av nyre, kan glomeruli være isolert intakt og med renhet ved hjelp av magnetiske separasjon9. I 1971 viste Misra at jernoksid infusjoner kan utelates og glomerular isolasjon med sikting av hakket menneske, hund, kanin eller rotte nyre vev10. Denne teknikken er endret siden så avhengig av målet med etterforskerne men egentlig har resultert i renset preparater som kan studeres videre eller som primært cellekulturer kan være etablert11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
Her beskriver vi en protokoll for isolering av intakt levedyktig glomeruli fra rotte nyrene. Hele protokollen tar bare noen få timer. Selv om de ikke sprer, kan eksperimentelle planer av alle størrelser støttes ved å øke antall nyrer som starter materiale. Mens det er publisert protokoller for magnetisk perle separasjon av glomeruli, de krever en intravenøs injeksjon av perler, er dyrere og kan endre biologi siden perlene beholdes enten av glomeruli i kultur eller krever glomerular” lysing”og fjerning av sentrifugering19. Sammenlignet med musen glomeruli, gjør den større størrelsen på rotte glomeruli (nesten 100 µm i to måneder gamle rotter18) det lettere å skille dem fra andre nyre strukturer ved hjelp av en enkel sieving teknikk.
Som bevis på sin nytteverdi, har vi preget glomeruli for å vise de forskjellige celletyper. De kan også være utsatt for agenter kjent å skade glomeruli i vivo, og vi viser de negative effektene av protamine sulfate (PS) på disse kulturene. PS er en polycation som nøytraliserer anionic områdene langs glomerular kapillær veggen20. Denne nøytralisering har en dramatisk effekt på glomerular filtrering barrieren og derfor øker proteinuria og fot prosessen effacement. Disse glomeruli kan vurderes med immunoblots for viktige proteiner som nephrin og WT1 å vurdere helse. Videre kan strukturen evalueres med lys, immunofluorescence og elektronmikroskop.
Samlet er denne protokollen tilgjengelig for de fleste etterforskere (en trenger bare tilgang til dyrene og noen enkle utstyr). Med morfologiske funksjoner igjen uskadd, forskeren er dugelig å analysere glomeruli og se hvordan andre viktige celletyper og matrix bevaring i glomeruli påvirke funksjonen og sykdom progresjon, en svakhet for podocyte kulturer.
Dette er en effektiv metode for å utvinne glomeruli fra rotte nyre billig, gjenbrukbare utstyr med en enkel protokoll. Som med alle prosedyrer, finnes det begrensninger å dens nytte. Først, selv om vi får > 95% renhet, hen sieving protokollen og den starte materialet det er umulig å utelate alle forurensninger, og noen røde blodlegemer og sporadiske rørformede segmentet finnes i kulturen. Vi regner ikke disse små forurensning er et problem for de aller fleste av programmer. Andre sieving protokollen er avhengig av bruken av rotte nyrene, der glomeruli er mye større enn mus. Hvis musen glomeruli er nødvendig, har en teknikken bruker kommersielle magnetiske perler (f.eksDynabeads) vært utgitt22. Tredje, har det vært vist at bestemte mRNAs (plasminogen aktivator inhibitor-1 og kollagen jeg) i isolerte glomeruli utlede nesten utelukkende fra Bowman’s capsule stedet intraglomerular celler23. Dette kan føre til upassende konklusjoner hvis mRNA isolasjon er forsøkt fra disse glomeruli. Det bør bemerkes at i våre hender fleste av glomeruli er decapsulated og bør derfor mangler betydelige bidrag fra Bowmans kapsler. Fjerde begynner celledød å oppstå relativt raskt under kultur forhold.
Vi fant at apoptotisk programmet, som dokumentert ved kløyvde caspase-3, ble aktivert fra 2t kultur. Dette er generelt avtale med tidligere rapporter viser at apoptose, som vurdert av DNA fragmentering, tunnel og histologic analyse, begynner å skje innen 1-2 h etter isolasjon24. Men bør det også bemerkes at tidlig observasjoner viste at metabolsk aktivitet ble oppdaget fra isolert soldet glomeruli når kultivert for minst 3 h, tyder betydelig mobilnettet levedyktighet på denne timepoint16. Likevel tror vi basert på resultatene, at det ville være forsvarlig å benytte isolert glomeruli umiddelbart i tiltenkte eksperimenter for de beste resultatene. Vi anbefaler at alle eksperimenter utføres før 72 h som vi har observert at hele glomerular strukturen begynner å svekkes utover det timepoint.
Det er mye lettere å få høyere avkastning når du starter med 4-8 nyrene i motsetning til bare 2 fordi et visst antall glomeruli er tapt på grunn av overholdelse av ulike sikter, men når sikter er maksimalt belagt det er ikke flere tap. Av samme grunn er det viktig å suge sikter i den BSA/PBS buffer før bruk som glomeruli er mer sannsynlig å følge en tørr sil og begrense vev eksponering til kanten av silen. Vi foreslår at du starter med ikke mindre enn 6 nyrene (3 rotter) å få en rimelig avkastning.
Noen etterforskere har isolert primære podocyte kulturer fra isolert glomeruli som pleier å vokse ut av glomeruli under kultur17. Vi har registrert at noen isolerte glomeruli vil følge kultur parabol plast og at celler vil begynne å overføre av glomerular strukturen på slutten timepoints (72 h etter isolasjon). Studiet av disse cellene er utenfor omfanget av denne isolasjon-protokollen, og det er noen uenighet om disse cellene er podocytes, parietal epitelceller eller både15,25. Spesielt Mundel et al., har rapportert at brosteinsbelagte celler høstet fra soldet glomeruli kan bli overtalt til å skille ut moden podocytes under bestemte dyrking forhold26. Noen av forvirring om cellen identitet kan avhenge av om de isolerte glomeruli er innkapslet (inkludert Bowman’s capsule som er befolket av parietal epitelceller) eller decapsulated i sieving prosedyren. I våre hender, bruke sekvensiell sil størrelser 180, 90 og 75 µm førte til fleste glomeruli blir decapsulated.
De fleste er proteinuric kronisk nyresykdom på grunn av økninger i glomerular permeabilitet. Flere forfattere har benyttet isolert glomeruli ex vivo permeabilitet eksperimenter. I en metode, ble endringen i glomerular volum etter endre osmotisk innholdet i omkringliggende media brukt til å beregne permeabilitet27. Nylig ble det etablert at lekkasje av en fluorescerende sonde fra isolert glomeruli kan kvantifiseres for å måle permeabilitet og kan utføres i gnagere utsatt for glomerular sykdom eksperimentelle modeller28.
Vi har bemerket at i TEM forberedelsesprosessen, vi noen ganger se podocyte fot prosesser løft av kjelleren membranen. Vi føler ikke dette skjer i kultur og er mer sannsynlig en gjenstand under TEM eksempel forberedelse. Spesielt, selv når dette skjer, er det klart om foten prosessene se “normal” eller er visket ut.
Samlet inneholder denne protokollen en metode som man kan vurdere morfologiske og cellulær endringer i respons til skade. Vi forventer at den kan brukes som en følgesvenn teknikk isolert podocyte kulturer, spesielt når interaksjon med ekstracellulær matrix eller andre innfødte celletyper vurderes. Det holder løftet for å øke forståelsen av proteinuric Parallelt, noe som vil øke muligheten til å utvikle fremtidige legemiddelselskap for denne ødeleggende sykdommen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association grant FTF 16990086, NIH P30 DK079307, American Society of Nephrology Gottschalk Award, en University of Pittsburgh Medical Center konkurransedyktig medisinsk forskning fondet Award og en University of Pittsburgh Leger akademiske Foundation Award. Vi takker Gerard Apodaca for hans tekniske forslag til glomerular bevaring for histologic analyse, Mara Sullivan og Ming solen for hjelp med elektronmikroskop, og Yingjian Li og Youhua Liu for deres faglige innspill i denne protokollen. Vi takker også Cynthia St. Hilaire CD31 antistoffer.
Solutions, Chemicals, and Animals | |||
Sprague-Dawley Rats | Envigo | 207M | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1605100 | |
Hank's Balanced Salt Solution with Ca2+ and Mg2+ | Thermo | 14025092 | |
1x Phosphate Buffered Saline | VWR | 97063-660 | |
Protamine sulfate | MP Bio | ICN15197105 | |
Karnovsky's Fixative | |||
Gelatin | |||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |
O.C.T. | Scigen | 23730571 | |
RIPA Buffer | |||
Halt Protease Inhibitors | Thermo | PI78442 | |
Nephrin Antibody | Fitzgerald | 2OR-NP002 | |
WT-1 Antibody | Abcam | ab89901-10ul | |
PDGFR-β Antibody | Cell Signaling | #3169S | |
CD31 Antibody | LSBio | LS-C348736 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling | 9661S | |
Poly/Bed 812 (Luft) epoxy | Polysciences | 08792-1 | |
Equipment | |||
Carbon dioxide chamber | |||
Conical tubes, 15 mL | |||
Conical tubes, 50 mL | |||
Surgical scissors | |||
Surgical forceps | |||
Sterile gauze | |||
Petri dishes, 100 mm | |||
Scalpels | |||
Razor blades | |||
Sterile filter apparatus | |||
Sieve Pan | Alfa Aesar | AA39999ON | |
180um Sieve | Alfa Aesar | AA39996ON | |
90um Sieve | Alfa Aesar | AA39990ON | |
75um Sieve | Alfa Aesar | AA39991ON | |
10 mL syringes | |||
600 mL beakers | |||
Cell culture incubator | |||
Picofuge | |||
Vortex | |||
Tissue Homogenizers | Fisher Scientific | 50550226 | |
20 G needles | |||
Leica Reichart Ultracut | ultramicrotome |